RNA-interferens (RNAi) er RNA-baseret post-transkriptionel gendæmpning, som forekommer i en lang række eukaryote organismer. Processen med RNAi udløses af endogene eller exogene dobbeltstrengede RNA (dsRNA) forstadier. DsRNA aktiverer ribonuklease protein Dicer, som binder og spalter dsRNA til små fragmenter (20-25 bp). Så de små fragmenter af dsRNA'et guide en anerkendelse og spaltning af komplementære mRNA ved argonaute proteiner, en katalytisk bestanddel af RNA-induceret silencing kompleks (RISC) ^1.. I pattedyr aktivere dsRNAs længere end 30 nt, et antiviralt respons (interferon respons, IFN), som fører til ikke-specifik nedbrydning af RNA transkripter ^2.. Imidlertid har lange dsRNAs vist sig at være effektiv og specifik i insekter, da der er en mangel på denne IFN ^3..

Lange dsRNAs er blevet anvendt til nedregulering af målgener i forskellige insektarter. Honningbier er en af ​​pionEER insekt organismer, hvor funktioner mange vigtige gener i udvikling og adfærd er blevet afsløret ved hjælp af dsRNA ^4,5. Adskillige dsRNA levering metoder er blevet udført i honningbier: dsRNA fodring effektivt nedregulerer target genekspression i honningbi larver ^6, mens dsRNA injektion er en effektiv metode til gen-knockdown i honningbi embryoner ⁴ og voksne bier ^7,8.

Gene Knockdown effekter udstillet ved anvendelse dsRNA til insekter er forbigående og lokaliseret. Undersøgelser har vist, at begge abdominal dsRNA injektioner og thorax dsRNA injektioner effektivt undertrykke målgenekspression i abdominal fedt kropsceller af insekter ^9,10. DsRNA sprøjtes ind mave-og thorax hulrum og fedt kropsceller er i stand til at tage op dsRNA fra hæmolymfe hvor cellerne er badet ^10.. Dog kan gener i andre organer, såsom æggestokke og hjerne, ikke målrettes ved entenabdominal eller thorax injektioner. For at målrette gener i honningbi hjerne, har hjerne injektion af dsRNA også blevet udført, hvilket faktisk påvirker målgenekspression i lokale områder i hjernen ^11. Her har vi kun dokumentere abdominal dsRNA indsprøjtning, som er mere almindeligt anvendt i voksne honningbier.

RNAi har primært været brugt til at målrette et enkelt gen, og har været et effektivt redskab til at afsløre genfunktionen. Imidlertid helst gen ikke isoleret fra andre, og det er i komplekse regulerende netværk. En nøgle til at forstå en biologisk proces er at dissekere hvordan gener interagerer med hinanden, hvilket kræver samtidige manipulationer af flere gener snarere end et enkelt gen Knockdown. I mammaliacellelinier, har forskerne lykkedes samtidig hæmmer to eller tre gener ved hjælp af doseringssystemer ¹² eller flere microRNA (miRNA) hårnål designs ^13.. Men i insekter, er flere gen knockdowns stadig uprøvet. Her har vi præsentat forskellige injektionssteder strategier, som kan opnå en dobbelt gen knockdown. Vi målretter to gener: vitellogenin (VG), som koder for en æggeblomme proteinprecursor, og ultraspiracle (USP), der koder for en putativ receptor for juvenil hormon (JH) og kan tjene som en transkriptionsfaktor medierende svar til JH ¹⁴ i honningbier. Vg og JH regulere hinanden i en feedback-sløjfe ¹⁵ og er involveret i honningbi adfærdsregulering ^9.. Brug af dobbelt-genet knockdown, vi forstyrrer både Vg og JH veje, og opdag, hvordan de i fællesskab påvirker honningbi adfærd og fysiologi, og hvordan vg, USP og JH interagere ^9..

Gustatory opfattelsen er en adfærdsmæssig indikator for honningbi social adfærd ^16. Med hensyn til adfærdsmæssige udvikling, reden bier med høj gustatory opfattelse adfærdsmæssigt modne hurtigt, og normalt foder tidligt i livet og foretrækker at indsamle pollen ^16,17. Selvom regulerende mechanisms underliggende gustatory opfattelse er stadig uklart, har undersøgelser vist, at gustatory opfattelse er knyttet til interne energi stofskifte ^9, hormonel sekretion ^18,19 og biogenetisk amin veje ^20. Både Vg og JH er vigtige hormonelle regulatorer modulerende gustatory opfattelse ^7,21. I laboratoriet kan en variation af gustatory opfattelse i honningbier blive evalueret ved at teste snabel forlængelse respons (PER) til forskellige rørsukkeropløsning. Hver bi testes ved at røre både hendes antenner med en dråbe vand efterfulgt af en stigende koncentration serie af 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% saccharose. Et positivt svar er noteret, hvis en bi fuldt udvider hendes snabel, når en dråbe vand eller sucrose er rørt til hver antenne. Baseret på antallet af positive reaktioner på de løsninger, kan smagssansen opfattelse niveauet af enkelte bestemmes ^16. Imidlertid er anvendelsen af ​​PER ikke begrænset til måling af gustatory perception. PER er også en effektiv metode til at teste den metaboliske tilstand af bier såsom mæthed vs sult. Bierne med større reaktioner på sucrose er mere sulten i almindelighed (Wang og Amdam, upublicerede data). Endvidere kan PER paradigme også anvendes i associativ indlæring og hukommelse i honningbier. I dette tilfælde bier vil blive uddannet til at associere tilstedeværelsen af ​​saccharose vand med en lugt. Når bierne lærer foreningen kan kun tilstedeværelsen af lugten fremkalde en positiv snabel respons uden at belønne dem med sucrose ^22,23. I denne video viser vi, hvordan du udfører PER at evaluere gustatory opfattelse, som har været forbundet med vg og USP dobbelt knockdown i en tidligere undersøgelse ^9..