Genmanipulation av Mouse Utveckla Hypothalamus genom<em> In utero</em> Elektroporering

Genetisk manipulation av embryonala mus hjärnan är en föredragen metod för att lära sig om utvecklings-reglering. Alstring av mutanta mus linjer är emellertid långsam och dyr. En kraftfull metod för att introducera specifika genetiska förändringar i utvecklingen av nervceller i däggdjur hjärnan är i livmodern elektroporering. Sammanfattningsvis består tekniken av transfekterande DNA i den embryonala hjärnan neuroepitelet med hjälp av elektriska pulser, sedan låta embryot att överleva under en viss tid, samla hjärnan och undersöka dem för eventuell roman, informativa fenotyper. På detta sätt, kan försöksledaren testa hypoteser nästan omedelbart utan långa väntetider är nödvändiga för framställning av mus mutanter.

Transfektion av DNA in i utvecklande embryon började med i ovo elektroporering på kycklingembryon ^1. Den väsentliga proof-of-concept för musen utfördes i kulturen <supp> 2. Detta följdes snart av de första beskrivningarna av tekniken på musen i livmodern ^3,4.

Det största problemet är att transfektera hjärnan av embryon utvecklas i livmodern utan att döda dem eller modern. Att lära sig att utföra nödvändig kirurgi (laparotomi, injektion, elektroporation) kräver en lång utbildningsperiod. När operationen har bemästrat till den punkt där embryoöverlevnad förhållandet är acceptabelt, är nästa viktiga fråga: vilka hjärnstrukturer är tillgängliga? Inte överraskande, den första publicerade artiklar visar resultat erhållna med i livmodern elektroporering fokuserat på kortikal utveckling ^5-9. Detta är fortfarande sant för de flesta av de publikationer som använder denna teknik, eftersom området för det sig utvecklande mushjärnan mest tillgängliga för kirurgiska ingrepp är cortex (figur 1). Förfarandet för i livmodern elektroporering in i cortex har beskrivitsi tryck ¹⁰ och i videon ^11-14. En modifiering av den teknik som kan användas för att rikta en ventral del av telencefalon, de basala ganglierna ^15.

Bortom telencephalon är diencefalon (klassiskt uppdelad i thalamus och hypotalamus) en region av framhjärnan svårare att nå. Ett litet antal papper rapporter riktar sin rygg och mest tillgängliga delen, thalamus ^16-19.

Hypotalamus är den mest ventrala delen av framhjärnan, varför en lokaliserad djupast från den dorsala ytan (cortex) (figur 1). Denna region är fortfarande en svår utmaning för forskarna åtagit sig att genetiskt manipulera mushjärnan i livmodern. Till vår kunskap, endast ett fåtal artiklar rapportera om resultaten av in utero transfektion i musen hypotalamus ^20,21. Emellertid den funktionella betydelsen av hypothalamus cannot överskattas, eftersom det reglerar beteenden som att äta och dricka, parning, avel och föräldraskap ^22. Dessutom förändringar i hypotalamus utveckling bidrar till att härröra senare i livet tillstånd som fetma, högt blodtryck, diabetes och för tidig pubertet ^23. Att kunna ändra genetiskt hypotalamus under utveckling skulle ge ett mycket kraftfullt verktyg för att förstå det.

Den grundläggande kirurgiska protokoll för laparotomi av dräktiga möss som vi använder här är liknande den som används i andra protokoll ^11,13,14,24. Vi kommer att beskriva dem här kort för fullständighet. Nyckeln till vårt förfarande, å andra sidan, är den typ av anestesi, platsen för injektionen, typen av elektroder och införande och placering av den positiva elektroden i förhållande till embryots huvud. Vi föredrar att inducera och underhålla anestesi genom gas inandning över enkel intraperitoneal anestesi, eftersom den förstnämnda möjliggörnågot längre narkos krävs för en svår operation. Isofluran inandning resulterar i snabbare återhämtning från anestesi, eftersom vanligtvis modern demonstrerar normalt beteende redan minuter efter operationen. Det enklaste punkten för injektion av DNA-lösningen med glasmikropipett är den laterala ventrikeln, som dock är helt olämpliga för hypotalamus elektroporering. Injektion direkt i den tredje ventrikeln är verkligen avgörande att rikta djupa diencephalic strukturer. Det är möjligt att transfektera hypotalamus från E12.0 eller E12.5 med standard, off-the-shelf elektroder. Vi har funnit en del av elektroderna som tillverkas av Nepa Gene (Chiba, Japan) särskilt lämpad för detta ändamål.

Med vårt förfarande erhåller vi transfektion av hela hypotalamus neuroepitelet eller delvis, regional transfektion beroende på elektrod orientering. Här kan vi demonstrera tekniken genom transfektion av mammillary kroppen, utan tvekanden djupaste och mest infälld allt hypotalamus kärnor. Dessutom visar vi detaljerad histologisk analys av de transfekterade cellerna ner till cellnivå av upplösning.

En jämförelse av i livmodern elektroporering med andra metoder för transfektion musen utvecklar hjärnan i livmodern kan hittas i diskussionen avsnittet.