Genetisk manipulering av musen Utvikling Hypothalamus gjennom<em> I utero</em> Electroporation

Genetisk manipulasjon av den embryoniske mus hjernen er en foretrukket metode for å lære om utviklingsmessige regulering. Generering av muterte mus linjer er imidlertid tregt og dyrt. En kraftig metode for å introdusere spesifikke genetiske endringer i utviklingen av nerveceller i hjernen hos pattedyr er i utero electroporation. I hovedsak består av teknikken for å transfektere DNA i den embryoniske hjerne neuroepithelium ved hjelp av elektriske pulser, så tillater embryoet for å overleve i en viss tid, samler hjernen og undersøker dem for mulig roman, informative fenotyper. På denne måten kan experimenter teste hypoteser nesten umiddelbart uten lange ventetider er nødvendige for produksjon av muse mutanter.

Transfeksjon av DNA i utviklingsland embryo startet med i ovo electroporation på kyllingembryo ^en. Den viktige proof-of-concept for musen ble utført i kultur <sopp> 2. Dette ble snart etterfulgt av de første beskrivelsene av teknikken på musen i fosterlivet ^3,4.

Hovedproblemet er å transfektere hjernen av embryoer utvikler seg i livmoren uten å drepe dem eller moren. Lære å utføre den nødvendige operasjonen (laparotomi, injeksjon, elektroporering) krever en lang treningsperiode. Når operasjonen har blitt mastret til det punktet hvor embryo overlevelse forholdet er akseptabelt, er den neste viktige spørsmålet: Hvilken strukturer i hjernen er tilgjengelige? Ikke overraskende, de første publiserte artikler viser resultatene som oppnås med i utero electroporation fokusert på hjernebarken ^5-9. Dette er fortsatt til stede for de fleste av publikasjonene ved hjelp av denne teknikken, ettersom den region av mus utvikler hjerne mest tilgjengelige for kirurgiske prosedyrer er cortex (figur 1). Fremgangsmåten for in utero elektroporering inn i korteks er blitt beskreveti ¹⁰ print og video ^11-14. En modifikasjon av den teknikk som kan brukes for å målrette et ventrale del av telencephalon, basal ganglia ^15..

Utover telencephalon, er diencephalon (klassisk delt i thalamus og hypotalamus) en region av forhjernen mer vanskelig å nå. Et lite antall papirer rapporter målretting av sin dorsal og mest tilgjengelige delen, thalamus ^16-19.

Hypotalamus er den mest ventrale del av forhjernen, derfor den ene lokaliserte dypest fra framsiden (cortex) (figur 1). Denne regionen er fortsatt en vanskelig utfordring for forskerne forpliktet til genetisk manipulere mus hjernen i fosterlivet. Så vidt vi vet, bare svært få artikler rapportere om resultater av i fosterlivet transfeksjon i musen hypothalamus ^20,21. Men den funksjonelle betydning av hypothalamus cannot overvurderes, siden det regulerer atferd som spiser og drikker, parring, avl og oppdragelse ^22. Videre endringer i hypothalamus utvikling bidrar til å stamme senere i livet tilstander som fedme, høyt blodtrykk, diabetes og veslevoksne puberteten ^23. Å kunne endre genetisk hypothalamus under utvikling vil gi et svært kraftig verktøy for å forstå det.

Den grunnleggende kirurgisk protokoll for laparotomi av drektige mus som vi bruker her er lik den som brukes i andre protokoller ^11,13,14,24. Vi vil beskrive dem her kort for fullstendighet. Nøkkelen til vår fremgangsmåte, på den annen side er typen av anestesi, stedet for injeksjonen, den type av elektroder, og innsetting og plassering av den positive elektroden i forhold til embryoet hode. Vi foretrekker å indusere og opprettholde anestesi gjennom gass inhalering over enkel intraperitoneal anestesi, ettersom den førstnevnte tillaternoe lengre perioder av narkose som kreves for en vanskelig operasjon. Isofluran innånding resulterer i raskere utvinning fra anestesi, siden vanligvis mor demonstrerer normal oppførsel allerede minutter etter operasjonen. Den enkleste punkt av injeksjon av den DNA-løsning med glasset mikropipette er den laterale ventrikkel, som imidlertid er helt uegnet for hypothalamus elektroporering. Injeksjon direkte i den tredje ventrikkel er faktisk avgjørende å målrette dype diencephalic strukturer. Det er mulig å transfektere hypothalamus fra E12.0 eller E12.5 med standard, off-the-sokkel elektroder. Vi har funnet noen av elektrodene fremstilt av Nepa Gene (Chiba, Japan) som er særlig egnet til dette formål.

Med prosedyre vår får vi transfeksjon av hele hypothalamus neuroepithelium eller delvis, regional transfeksjon avhengig av elektroden orientering. Her kan vi demonstrere teknikken ved transfektere den mammillary kroppen, uten tvilden dypeste og mest innfelt av alt hypothalamus kjerner. I tillegg, viser vi detaljert Histologisk analyse av de transfekterte cellene ned til det cellulære nivået av oppløsning.

En sammenligning av i utero electroporation med andre tilnærminger til transfeksjon musen utviklingen av hjernen i fosterlivet kan bli funnet i diskusjonen delen.