Summary

Genetisk manipulering av musen Utvikling Hypothalamus gjennom<em> I utero</em> Electroporation

Published: July 24, 2013
doi:

Summary

Til tross for den funksjonelle og medisinsk viktighet av hypothalamus,<em> I fosterlivet</em> Genetisk manipulering av sin utvikling har sjelden vært forsøkt. Vi viser en detaljert prosedyre for<em> I fosterlivet</em> Elektroporering i musen hypothalamus og viser representative resultatene av total og partiell (regional) hypothalamus transfeksjon.

Abstract

Genmodifisering av spesifikke regioner av utviklingsland hjernen hos pattedyr er en svært kraftig eksperimentell tilnærming. Men, genererer nye mus mutanter er ofte frustrerende trege. Det har blitt vist at tilgang til musen hjernen utvikler seg i livmoren med rimelig post-operatory overlevelse er mulig. Likevel har resultatene med denne prosedyren blitt rapportert nesten utelukkende for den mest overfladiske og lett tilgjengelig del av utviklingen av hjernen, dvs. cortex. Thalamus, en smalere og mer medial regionen, har vist seg vanskeligere å målrette. Transfection inn dypere kjerner, spesielt de av hypothalamus, er kanskje de mest utfordrende og derfor svært få resultater har blitt rapportert. Her viser vi en prosedyre for å målrette hele hypothalamus neuroepithelium eller deler av det (hypothalamus regioner) for transfeksjon gjennom elektroporering. Nøklene til vår tilnærming er lengre narkose ganger, injeksjon i tHird ventrikkel, og hensiktsmessig form og plassering av elektrodene. I tillegg har vi viser resultatene av målretting og påfølgende histologisk analyse av de forsenkede hypothalamus kjernen, den mammillary legeme.

Introduction

Genetisk manipulasjon av den embryoniske mus hjernen er en foretrukket metode for å lære om utviklingsmessige regulering. Generering av muterte mus linjer er imidlertid tregt og dyrt. En kraftig metode for å introdusere spesifikke genetiske endringer i utviklingen av nerveceller i hjernen hos pattedyr er i utero electroporation. I hovedsak består av teknikken for å transfektere DNA i den embryoniske hjerne neuroepithelium ved hjelp av elektriske pulser, så tillater embryoet for å overleve i en viss tid, samler hjernen og undersøker dem for mulig roman, informative fenotyper. På denne måten kan experimenter teste hypoteser nesten umiddelbart uten lange ventetider er nødvendige for produksjon av muse mutanter.

Transfeksjon av DNA i utviklingsland embryo startet med i ovo electroporation på kyllingembryo en. Den viktige proof-of-concept for musen ble utført i kultur <sopp> 2. Dette ble snart etterfulgt av de første beskrivelsene av teknikken på musen i fosterlivet 3,4.

Hovedproblemet er å transfektere hjernen av embryoer utvikler seg i livmoren uten å drepe dem eller moren. Lære å utføre den nødvendige operasjonen (laparotomi, injeksjon, elektroporering) krever en lang treningsperiode. Når operasjonen har blitt mastret til det punktet hvor embryo overlevelse forholdet er akseptabelt, er den neste viktige spørsmålet: Hvilken strukturer i hjernen er tilgjengelige? Ikke overraskende, de første publiserte artikler viser resultatene som oppnås med i utero electroporation fokusert på hjernebarken 5-9. Dette er fortsatt til stede for de fleste av publikasjonene ved hjelp av denne teknikken, ettersom den region av mus utvikler hjerne mest tilgjengelige for kirurgiske prosedyrer er cortex (figur 1). Fremgangsmåten for in utero elektroporering inn i korteks er blitt beskreveti 10 print og video 11-14. En modifikasjon av den teknikk som kan brukes for å målrette et ventrale del av telencephalon, basal ganglia 15..

Utover telencephalon, er diencephalon (klassisk delt i thalamus og hypotalamus) en region av forhjernen mer vanskelig å nå. Et lite antall papirer rapporter målretting av sin dorsal og mest tilgjengelige delen, thalamus 16-19.

Hypotalamus er den mest ventrale del av forhjernen, derfor den ene lokaliserte dypest fra framsiden (cortex) (figur 1). Denne regionen er fortsatt en vanskelig utfordring for forskerne forpliktet til genetisk manipulere mus hjernen i fosterlivet. Så vidt vi vet, bare svært få artikler rapportere om resultater av i fosterlivet transfeksjon i musen hypothalamus 20,21. Men den funksjonelle betydning av hypothalamus cannot overvurderes, siden det regulerer atferd som spiser og drikker, parring, avl og oppdragelse 22. Videre endringer i hypothalamus utvikling bidrar til å stamme senere i livet tilstander som fedme, høyt blodtrykk, diabetes og veslevoksne puberteten 23. Å kunne endre genetisk hypothalamus under utvikling vil gi et svært kraftig verktøy for å forstå det.

Den grunnleggende kirurgisk protokoll for laparotomi av drektige mus som vi bruker her er lik den som brukes i andre protokoller 11,13,14,24. Vi vil beskrive dem her kort for fullstendighet. Nøkkelen til vår fremgangsmåte, på den annen side er typen av anestesi, stedet for injeksjonen, den type av elektroder, og innsetting og plassering av den positive elektroden i forhold til embryoet hode. Vi foretrekker å indusere og opprettholde anestesi gjennom gass inhalering over enkel intraperitoneal anestesi, ettersom den førstnevnte tillaternoe lengre perioder av narkose som kreves for en vanskelig operasjon. Isofluran innånding resulterer i raskere utvinning fra anestesi, siden vanligvis mor demonstrerer normal oppførsel allerede minutter etter operasjonen. Den enkleste punkt av injeksjon av den DNA-løsning med glasset mikropipette er den laterale ventrikkel, som imidlertid er helt uegnet for hypothalamus elektroporering. Injeksjon direkte i den tredje ventrikkel er faktisk avgjørende å målrette dype diencephalic strukturer. Det er mulig å transfektere hypothalamus fra E12.0 eller E12.5 med standard, off-the-sokkel elektroder. Vi har funnet noen av elektrodene fremstilt av Nepa Gene (Chiba, Japan) som er særlig egnet til dette formål.

Med prosedyre vår får vi transfeksjon av hele hypothalamus neuroepithelium eller delvis, regional transfeksjon avhengig av elektroden orientering. Her kan vi demonstrere teknikken ved transfektere den mammillary kroppen, uten tvilden dypeste og mest innfelt av alt hypothalamus kjerner. I tillegg, viser vi detaljert Histologisk analyse av de transfekterte cellene ned til det cellulære nivået av oppløsning.

En sammenligning av i utero electroporation med andre tilnærminger til transfeksjon musen utviklingen av hjernen i fosterlivet kan bli funnet i diskusjonen delen.

Protocol

En. Utarbeidelse av DNA og Glass Mikropipetter for Injection God kvalitet glass mikropipetter er avgjørende for å redusere innledende høy aborttall grunn av tap av fostervann. Prosedyren for å trekke glass mikropipetter har blitt godt dokumentert 13,18,25. Bruk 1,2 mm diameter kapillærer trekkes i en konvensjonell Sutter P-97 enhet med innstillingene P = 500; Heat = 300; Trekk = 40; Velocity = 50; tid = 50. Monter avtrekker med 3 mm "trough" filamenter (Sutter Instrument FT330B). De …

Representative Results

De fleste hypothalamus nevroner er født mellom E11.5 til E15.2, ifølge fødsel-dating analyse hos rotte 26 oversettes til noe kortere mus utvikling 27,28. Toppen av hypothalamus neurogenesis nås ved E12.5 29-31. Følgelig, ved transfeksjon alder valgt for dette studiet (E12.5), kan en stor andel av hypotalamiske neuroner merkes til enhver rostro-kaudal nivå. Analyse ved E18.5 på tykke vibratome-type seksjoner (figurene 3A og 3B)<…

Discussion

Om anestesi: Siden i utero electroporation inn i hypothalamus kan være teknisk krevende og krever lengre narkose ganger, foretrekker vi å indusere og vedlikeholde anestesi ved administrasjon av en blanding av oksygen og isofluran. I vår erfaring, kan dyr være hensiktsmessig bedøvet på denne måten i perioder på inntil én time minst, er utvinning av moren veldig fort, og embryo overlevelse forbedret. Andre tilnærminger til anestesi er også tilgjengelig. Den enkleste fremgangsmåte består i å indusere…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble finansiert av den tyske Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

Materials

      REAGENTS
Acepromazine Sanofi GmbH   anesthetic
Isoflurane Baxter HDG9623 anesthetic
Ketamin Pharma GmbH   anesthetic
Fast Green Fluka 44715  
Rimadyl Pfizer   non-steroidal anti-inflammatory
Braunoderm Braun 3887138 povidone-iodine
Phosphate Buffer Saline PBS Gibco 14190  
Temgesic (buprenorphine) Essex Pharma   opioid analgesic
Eye Ointment Pan-Ophtal 7136926  
Xylazine Bayer    
      EQUIPMENT
Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 Medical Developments Australia ACN 004 903 682  
Capillary puller P-97 Sutter Instrument Co. P-97  
Compresstome Precisionary Instr. VF-300 Vibratome-type device
Confocal Microscope Zeiss LSM700  
Cryostat Leica CM3050S  
Electroporator Nepa Gene Co. Ltd. CUY21EDIT  
Electrode 1 Nepa Gene Co. Ltd. CUY550-10 Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.
Electrode 2 Nepa Gene Co. Ltd. CUY700P4L Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter
Fiberoptic cold light source Leica KL2500 LCD  
Glass capillaries Harvard Apparatus GC120T-15 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.
Glass bead sterilizer Fine Science Tools FST250  
Heating pad Harvard Apparatus py872-5272  
Injection device World Precision Instruments Pneumatic Pico Pump PV820  
Suture Thread Coated Vicryl Ethicon V4914 Peritoneal Suture
Suture Thr. Supramid Serag Wiessner TO07171L Skin Suture

Referências

  1. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
  2. Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociência. 103, 865-872 (2001).
  5. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
  7. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
  8. Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
  9. Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  12. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
  13. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  14. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
  15. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
  16. Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27 (2012).
  17. Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
  18. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  19. Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
  20. Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
  21. Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
  22. Canteras, N. S., Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. . The Mouse Nervous System. , 539-562 (2011).
  23. Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
  24. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).
  25. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).
  26. Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
  27. Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neurociência. 105, 7-17 (2001).
  28. Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
  29. Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
  30. Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
  31. Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
  32. Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4 (2012).
  33. Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
  34. Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O’Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
  35. Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).
  36. Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
  37. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
  38. Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
  39. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  40. Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
  41. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  42. Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).

Play Video

Citar este artigo
Haddad-Tóvolli, R., Szabó, N., Zhou, X., Alvarez-Bolado, G. Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (77), e50412, doi:10.3791/50412 (2013).

View Video