Генетических манипуляций мышью Разработка Гипоталамус через<em> В утробе матери</em> Электропорацию

Генетические манипуляции с эмбриональными мозга мыши является предпочтительным подходом, чтобы узнать о развитии регулирования. Поколение мутантных линий мышей, однако, медленно и дорого. Один мощный метод введения специфических генетических изменений в развивающихся нейронов мозга млекопитающих является внутриутробно электропорации. По сути, методика состоит из трансфекции ДНК в эмбриональных нейроэпителия мозг посредством электрических импульсов, затем позволяя эмбриона выжить в течение определенного периода времени, собирают мозга и исследовать их возможного романа, информативным фенотипов. Таким образом, экспериментатор может проверить гипотезу почти сразу же, без длительных периодов ожидания необходимые для производства мутантных мышей.

Трансфекции ДНК в развивающихся эмбрионах началось с ово в электропорации на куриных эмбрионах ^1. Существенным доказательством правильности концепции для мыши проводили в культуре <sдо> 2. Это было вскоре последовали первые описания техники на мыши внутриутробно ^3,4.

Основная проблема заключается в трансфекции мозга эмбрионов развивается внутриутробно, не убивая их или матери. Изучение выполнить необходимые операции (лапаротомию, инъекцию, электропорацию) требует длительного периода подготовки. Как только операция была освоена до точки, где соотношение выживаемость эмбрионов является приемлемым, следующий ключевой вопрос: какие структуры мозга доступны? Не удивительно, что первые опубликованных работ показывает результаты, полученные с внутриутробно электропорации сосредоточены на развитии коркового ^5-9. Это по-прежнему верно для большинства публикаций с помощью этой техники, так как область развивающегося мозга мыши наиболее доступной для хирургических процедур коры (рис. 1). Процедура внутриутробно электропорации в коре была описанав печати в ¹⁰ и ^11-14 видео. Модификация методика может быть использована для нацеливания на вентральной частью конечного мозга, базальных ганглиев ^15.

За конечный мозг, промежуточный мозг (классически разделен на таламус и гипоталамус) является областью переднего мозга труднее достичь. Небольшое число работ, отчетов адресности его спинной и наиболее доступной части таламуса ^16-19.

Гипоталамус является самой вентральной части переднего мозга, поэтому один локализованный наиболее глубоко из дорсальной поверхности (кора) (рис. 1). Этот регион остается трудной задачей для исследователей стремится к генетически манипулировать мозга мышей в период внутриутробного развития. Насколько нам известно, лишь очень немногие статьи отчета об итогах внутриутробно трансфекции в гипоталамусе мышей ^20,21. Однако функциональное значение гипоталамуса cannoт быть завышена, так как она регулирует поведение, как еда и питье, спаривание, селекции и воспитания ^22. Кроме того, изменения в развитии гипоталамуса способствовать происходят позже в жизни условиях, таких как ожирение, гипертония, диабет и преждевременное половое созревание ^23. Будучи в состоянии изменить генетически гипоталамуса во время развитию обеспечит очень мощный инструмент, чтобы понять это.

Основной хирургический протокол для лапаротомии беременных мышей, которые мы используем здесь аналогична использованной в других протоколов ^11,13,14,24. Мы опишем здесь кратко рассказать для полноты картины. Ключом к нашему процедура, с другой стороны, являются тип анестезии месте инъекции, тип электродов и вставки и позиции положительного электрода по отношению к голове эмбриона. Мы предпочитаем, чтобы вызвать и поддерживать наркоз посредством вдыхания газа по сравнению с простыми анестезии внутрибрюшинной, поскольку оно включает в себяНесколько более длительных периодов наркоза при тяжелую операцию. Isoflurane результаты ингаляции в быстрое восстановление после анестезии, так как обычно мать демонстрирует нормальное поведение уже минут после операции. Самый простой точке ввода этого раствора ДНК со стеклянной микропипетки в боковой желудочек, который, однако, совершенно непригодны для гипоталамус электропорации. Инъекций непосредственно в третий желудочек действительно важно, чтобы целевой глубоко диэнцефальных структур. Вполне возможно, для трансфекции гипоталамус от E12.0 E12.5 или со стандартными, имеющийся в наличии электроды. Мы обнаружили некоторые из электродов производства Nepa гена (Chiba, Япония), особенно хорошо подходят для этой цели.

С нашим образом получаем трансфекции всего гипоталамуса нейроэпителия или частичное, региональных трансфекции в зависимости от ориентации электрода. Здесь мы показываем, метод, с помощью трансфекции тела сосцевидный, возможно,Самая глубокая и встраиваемые всех ядрах гипоталамуса. Кроме того, мы покажем подробный гистологический анализ трансфекции клеток вплоть до клеточного уровня разрешения.

Сравнение внутриутробно электропорации с другими подходами к трансфекции мыши развивающегося мозга внутриутробно, можно найти в разделе обсуждения.