Akım Sitometri tarafından İnsan Nötrofiller Nükleer Faktör Aktivasyon Algılama Basit ve Verimli Yöntemi
Summary
Nötrofiller, kan içinde en bol bulunan lökositlerin vardır. Nötrofiller proinflamatuar sitokinlerin ve apopitoz inhibisyonu üretimi gibi transkripsiyonel düzenlenir fonksiyonları sahip. Bu işlevler izole çekirdeklerinde flow sitometri ile nükleer faktörlerin tespiti ve ölçümü sağlar Burada sunulan yöntem ile ele alınabilir
Abstract
Nötrofiller periferik kanda en bol lökosit vardır. Bu hücreler böylece mikroorganizmaların işgalci karşı ilk savunma hattı olma, inflamasyon ve enfeksiyon sitelerinde görünmesini ilk. Nötrofiller gibi fagositoz, parçalayıcı enzimlerin salınımı, ve reaktif oksijen türlerinin üretimi gibi önemli antimikrobiyal fonksiyonları sahip. Bu önemli savunma işlevlerine ek olarak, nötrofillerin proinflamatuar sitokinlerin ve apopitoz inhibisyonu üretimi gibi enfeksiyonuna yanıt olarak diğer görevleri yerine getirir. Sitokinler enfeksiyonu temizlemek yardımcı olan diğer lökositler işe ve apopitoz inhibisyonu nötrofil enfeksiyon yerinde uzun yaşamalarını sağlar. Bu işlevler, transkripsiyon seviyesinde düzenlenir. Nötrofiller kısa ömürlü hücreler çünkü herhangi bir verimli olduğu için Bununla birlikte, bu hücreler içinde transkripsiyonel yanıtlar düzenlenmiş bir çalışma geleneksel raportör gen yöntemler ile gerçekleştirilemezNötrofil transfeksiyon için cient teknikleri. Burada, flow sitometri ile izole ve immunolabeled çekirdeklerindeki nükleer faktörlerin tespiti ve ölçümü sağlayan basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Biz insan periferik kan saf nötrofilleri izole teknikleri tanımlamak, anti-reseptör antikorları ile bu hücreleri uyarmak yalıtmak ve immunolabel çekirdekler ve flow sitometri ile çekirdekler analiz. Yöntem başarılı bir şekilde nötrofiller ve diğer hücre türleri çekirdeklerinde NF-KB ve Elk-1 nükleer faktör tespit etmek için kullanılmıştır. Bu yüzden, bu yöntem, hücre tiplerinde izole edilen çekirdeklerin içinde transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonu analiz etmek için bir seçenek oluşturmaktadır.
Introduction
Nötrofiller, periferik kan 1. en bol bulunan lökositlerin vardır. Inflamasyon ve enfeksiyon nötrofiller sırasında onlar savunma 2 ilk satırı olarak hareket nereye etkilenen sitesinde görünmeye ilk hücrelerdir. Nötrofiller fagositoz, reaktif oksijen türlerinin üretimi, degranülasyonu tarafından parçalayıcı enzimlerin salınımı, ve 4,5 proinflamatuar sitokinlerin üretimi dahil olmak üzere birçok antimikrobiyal mekanizmaları 3 sahiptirler. Nötrofiller hızla çeşitli hücre yüzey reseptörler aracılığıyla aktif olsun kısa ömürlü hücrelerdir. Nötrofiller, kısa ömrü nedeniyle terminali hücreler sayılır ve inflamatuar süreç 6 sırasında aktive sürece apoptoz geçmesi, çünkü onlar da belirli genlerin transkripsiyon düzeyini değiştirerek onların fenotip değiştirebilirsiniz artık açıktır olmasına rağmen. Sitokinler 5 ve apoptoz ile 7,8 inhibisyonu üretim iki tanesi important aktivasyonu-bağımlı hücre fonksiyonlarını nötrofillerde transkripsiyon seviyesinde düzenlenir. Nükleer faktör kappa B (NF-kB) sitokin üretimi 4 transkripsiyonel kontrolü ve hücre canlılığı ve çeşitli hücre tiplerinde apoptoz 9-11 düzenlenmesinde katılır.
Nükleer faktör aktivasyonu neden sinyal yollarının genellikle muhabir gen deneyleri veya elektroforetik hareketlilik kayma analizi (EMSA) tarafından incelenmiştir. Nötrofiller kısa ömürlü hücreler, çünkü nötrofil transfeksiyon için bir etkili teknikler vardır Bununla beraber, bu hücreler içinde transkripsiyonel yanıtlar düzenlenmiş çalışması, haberci gen deneyleri ile gerçekleştirilemez. EMSA deneyleri nükleer faktör aktivasyon 12,13 keşfetmek için nötrofillerin kullanılmış olan, bu radyoaktif maddelerin kullanımı içerir çünkü ancak bu yöntem karmaşık ve pahalıdır. Nucleofection successfu kullanılmış olan diğer bir tekniktirlly monositler 14 transferinde. Böylece, en azından teoride, nükleer faktör aktivasyonu (düşük verimlilik rağmen) transfeksiyon tarafından nötrofil tespit edilebilir. Bununla birlikte, bu yöntem daha pahalı ve zaman alıcı bir olasılıkla daha az miktar olacaktır. Immunohistokimyasal hücrelerin mikroskopik analiz aynı zamanda çekirdek içinde nükleer faktör tespit etmek için kullanılabilir. Nitekim, biz çekirdeği bu şekilde 15 içine NF-KB translokasyon tespit ettik. Ne yazık ki, bu tekniğin ayrıca, zaman alıcı az nicel ve gözlemcinin önyargı tabidir.
Burada, flow sitometri ile izole ve immunolabeled çekirdeklerindeki nükleer faktörlerin tespiti ve ölçümü sağlayan basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Biz insan periferik kan nötrofillerin izole teknikleri tanımlamak, (F, anti-reseptör antikorları ile integrinler veya Fc reseptörleri aracılığıyla bu hücreleri uyarmak yalıtmak ve immunolabel çekirdekler ve flow sitometri ile çekirdekler analizŞEKIL 1). Yöntem başarılı bir NF-KB 15 ve nötrofil çekirdekler Elk-1 16 nükleer faktör tespit etmek için kullanılmıştır. Bu yöntemin duyarlılığı çekirdek içinde nükleer faktör seviyeleri küçük değişiklikleri algılama izin verir. Bu yöntem ayrıca diğer hücre tipleri arasından çekirdeklerinde transkripsiyon faktörlerinin düzeyini analiz etmek için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada anlatılan arınma yöntemi kısa bir süre içinde% 95 (mikroskobik gözlem yoluyla belirlenmiştir), daha yüksek saflıkta uyarılmamış nötrofillerin izolasyonu (PMN) verir. İkincisi tamamen lize değilseniz Bazen nötrofiller eritrositler kirlenmiş olabilir. Eritrositler ve PMN kolayca flow sitometri ile farklı hücre popülasyonlarının olarak ayırt edilebilir çünkü bu, genellikle, teknik etkilemez. İzole PMN sonra spesifik monoklonal antikorlar ile çapraz bağlama belirli reseptörler ile stim?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar onun teknik yardım için Nancy Mora teşekkür etmek istiyorum.
Bu çalışma Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Meksika, araştırma destekleri 48573-M ve 168098 tarafından hibe IN212308 ve IN205311-2 Direccion General de Asuntos del Kişisel Academico, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Meksika tarafından finanse edildi.
Materials
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur |
Referências
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
