Pyrosequencing für Mikrobielle Identifizierung und Charakterisierung
Summary
Pyrosequencing ist eine vielseitige Technik, die mikrobielle Genom-Sequenzierung, die verwendet werden, um bakterielle Spezies identifizieren, diskriminieren Bakterienstämme und erkennen genetische Mutationen, die eine Resistenz gegen antimikrobielle Mittel werden erleichtert. In diesem Video, wird das Verfahren für die mikrobielle Amplikon Generation Amplikon pyrosequencing und DNA-Sequenzanalyse nachgewiesen werden.
Abstract
Pyrosequencing ist eine vielseitige Technik, die mikrobielle Genom-Sequenzierung, die verwendet werden, um bakterielle Spezies zu identifizieren, zu unterscheiden und zu erkennen Bakterienstämme genetische Mutationen, die eine Resistenz gegen antimikrobielle Mittel werden erleichtert. Die Vorteile für die Mikrobiologie Pyrosequenzierungs Anwendungen sind schnelle und zuverlässige Hochdurchsatz-Screening und genaue Identifizierung der Mikroorganismen und mikrobielle Genmutationen. Pyrosequencing betrifft die Sequenzierung von DNA durch Synthetisieren des komplementären Strangs einer einzigen Basisstation zu einer Zeit, bei der Ermittlung der spezifischen Nukleotids während der Synthesereaktion eingearbeitet. Die Reaktion erfolgt an immobilisierten einzelsträngigen Matrizen-DNA, wo die vier Desoxyribonukleotide (dNTP) nacheinander zugegeben und nicht-eingebauten dNTPs enzymatisch abgebaut werden vor der Zugabe der nächsten dNTP der Synthesereaktion. Nachweis der spezifischen Base in der Vorlage enthalten ist durch Erzeugung chemilum überwachtinescent Signale. Die Reihenfolge der dNTPs, die die Chemilumineszenz zu erzeugen bestimmt die DNA Sequenz der Matrize. Die Echtzeit-Sequenzierung Fähigkeit Pyrosequenzierungstechnologie ermöglicht eine schnelle Identifizierung von Mikroorganismen in einem einzigen Assay. Darüber hinaus ist die Pyrosequencing Instrument, analysieren die volle genetische Vielfalt der antimikrobiellen Resistenzen, einschließlich Typisierung von SNPs, Punktmutationen, Insertionen, Deletionen und sowie Quantifizierung mehrerer Genkopien, die in irgendeiner Antibiotikaresistenz auftreten können Mustern.
Introduction
Pyrosequencing ist eine schnelle und genaue Methode zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der "Sequenzierung durch Synthese" basiert. "Sequenzierung durch Synthese" beinhaltet die Verwendung einer Einzelstrang-DNA-Vorlage, um den komplementären Strang einer Basisstation zu einer Zeit zu synthetisieren, und Erfassen der eingebaute Base (A, T, G oder C) bei jedem Schritt durch die Erfassung eines Chemilumineszenz-Signals. Die Reaktion umfasst Pyrosequenzierungs Matrizen-DNA, dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA-Polymerase, ATP-Sulfurylase, Luciferin, Luciferase und Apyrase. Die Synthesereaktion wird durch die Zugabe von einer der vier dNTPs und DNA-Polymerase an den biotinylierten einzelsträngigen Matrizen-DNA initiiert. DNA-Polymerase enthält die komplementären dNTP auf die Schablone, mit der anschließenden Freisetzung von Pyrophosphat (Abbildung 1). ATP Sulfurylase anteilig wandelt das Pyrophosphat zu ATP. ATP wirkt als Katalysator für die Luciferase vermittelte Umwandlung von Luciferin zu Oxyluciferin, dasLicht erzeugt (Abbildung 2). Die Intensität des Lichts ist proportional zu der Anzahl von Nucleotiden enthalten und bestimmt, ob ein oder mehrere spezifische dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP oder) ist auf dem Template-Strang sequentiell (Abbildung 3). Jede unincorporated dNTP abgebaut Apyrase vor der Zugabe der nächsten dNTP für die Fortsetzung der Synthesereaktion. Dieses "Sequenzierung durch Synthese" Reaktion wird unter Zusatz von jedem der vier dNTPs wiederholt, bis die DNA-Sequenz der einzelsträngigen DNA-Matrize bestimmt.
Um eine Animation der Pyrosequencing Reaktion sehen Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Protocol
Representative Results
Discussion
Mehrere neue Next Generation Sequencing Methoden wurden kommerzialisiert. Drei der am häufigsten verwendeten Methoden sind Ionen-Halbleiter-Sequenzierung, einzelnes Molekül Echtzeit-Sequenzierung und Sequenzierung durch Synthese (SBS). 3-11 Jede dieser Methoden hängt Sequenzierung durch Synthese, sondern beschäftigen neuartige Plattformen für den Nachweis der eingebauten Nukleotide. In Ion Halbleiter-Sequenzierung, dient ein einzelner DNA-Strang als Vorlage für die Sequenzierung Strang. Polymerase und 12 Nukleotide nacheinander wie in pyrosequencing aufgenommen. Wenn ein Nukleotid auf die wachsende DNA-Strang hinzugefügt wird, wird ein Wasserstoffion freigegeben. Die Wasserstoffionenkonzentration wird durch einen Feldeffekttransistor Basis erfasst.
Einzel-Molekül Echtzeit-Sequenzierung abhängig von der Null-Modus Wellenleiter (ZMW). 13 Die ZMW ist eine kleine Struktur, wo ein einzelnes Molekül der Polymerase Boden des Schachtes befestigt ist. Es wird in einer solchen Weise, dass ein Flore beleuchtetDuft-Molekül erkannt werden können. Jedes Nukleotid mit einem fluoreszierenden Molekül markiert. Als fluoreszierend markierten Nukleotid eingebaut identifiziert ein Detektor die Nukleotidsequenz. Wenn die nächste Nukleotid hinzugefügt wird, wird das fluoreszierende Molekül abgespalten. 14
Sequenzierung durch Synthese (SBS) nutzt eine einzigartige Methode zur Amplifikation der Ziel-DNA, so dass Cluster einzigartige Sequenzen erzeugt werden. 15 Einzel-Matrizen erzeugt werden und dann der komplementäre Strang synthetisiert wird. Jedes Nukleotid mit einem fluoreszierenden Molekül markiert ist und nach jeder Basenzugabe die Fluoreszenz des zugesetzten Base wird aufgezeichnet.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt war die Unterstützung teilweise durch Johns Hopkins University, Büro des Provost durch die Gateway-Initiative Wissenschaft im Dialog und Qiagen Inc.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| PyroMark PCR Master Mix, 2x | Qiagen | 978703 | |
| CoralLoad Concentrate, 10x | Qiagen | 978703, 978705 | |
| Q-Solution, 5x | Qiagen | 978703, 978705 | |
| MgCl2, 25 mM | Qiagen | 978703, 978705 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| Primers | Qiagen | 978776 or 978777 | Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM. |
| Pyromark Gold Q24 Reagents | Qiagen | 970802 | |
| High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent) | |||
| Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-07 | |
| PyroMark Annealing Buffer | Qiagen | 979009 | |
| PyroMark Denaturation Solution | Qiagen | 979007 | |
| PyroMark Wash Buffer | Qiagen | 979008 | |
| PyroMark Q24 | Qiagen | 9001514 | |
| PyroMark Q24 Cartridge | Qiagen | 979202 | |
| PyroMark Q96 HS Tip Holder Box | Qiagen | 979105 | |
| PyroMark Q24 Vacuum Workstation | Qiagen | 9001516 | |
| PyroMark Q24 Plate Holder | Qiagen | 9022273 | |
| Orbital shaker | Fisher | 11-675-297 | |
| Heat block | Fisher | 11-718Q |
Referências
- . . PyroMark PCR Handbook. , (2009).
- . . PyroMark Q24 User Manual. , (2012).
- Elahi, E., Ronaghi, M. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).
- Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).
- Langaee, T., Ronaghi, M. Genetic variation analyses by pyrosequencing. Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).
- Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis. Nucleic Acids Res. 35 (18), e120 (2007).
- Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes. J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).
- J, Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
- Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data. Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).
- Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).
- King, C., Scott-Horton, T. Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping. J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).
- Rothberg, J. W., Heinz, , et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
- Eid, J., Fehr, A. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
