Bepaling van Microbiële extracellulaire enzymactiviteit in Waters, bodem en sedimenten behulp High Throughput Microplaat Testen
Summary
Microplaat procedures beschreven voor de colorimetrische of fluorometrische analyse van extracellulaire enzymactiviteit. Deze procedures zorgen voor de snelle bepaling van een dergelijke activiteit in grote aantallen milieu-monsters er binnen afzienbare tijd frame.
Abstract
Een groot deel van de cycli van nutriënten en koolstof verwerking in natuurlijke omgevingen gebeurt door de activiteit van extracellulaire enzymen vrij door micro-organismen. Zo kan het meten van de activiteit van deze extracellulaire enzymen inzicht te geven in de tarieven van de ecosysteem-niveau processen, zoals afbraak van organisch materiaal en stikstof en fosfor mineralisatie. Testen van extracellulaire enzymactiviteit in milieu monsters gewoonlijk uit het blootstellen van de monsters naar kunstmatige colorimetrische of fluorometrische substraten en het bijhouden van de snelheid van substraathydrolyse. Hier beschrijven we microplaat-methoden, voor deze procedures die de analyse van grote aantallen monsters binnen een kort tijdsbestek mogelijk te maken. Monsters worden reageren met kunstmatige substraten in 96 putjes microplaten of diepe microplaat blokken en enzymactiviteit wordt vervolgens bepaald door absorptie of fluorescentie van het verkregen eindproduct met een typische microplaat lezer of fluorometer. Dergelijke hoge throughput procedures niet alleen vergelijkingen tussen ruimtelijk verschillende plaatsen of ecosystemen vergemakkelijken, maar ook de kosten van dergelijke tests aanzienlijk beperken door algemene reagensvolumes nodig per monster.
Introduction
Micro-organismen zoals bacteriën en schimmels verkrijgen voedingsstoffen en koolstof uit complexe organische verbindingen door de productie van extracellulaire enzymen. Deze enzymen hydrolyseren typisch polymeren in kleinere subeenheden die in de cel kan worden genomen. Daarom op een ecologisch vlak, deze microbiële extracellulaire enzymen verantwoordelijk voor veel van de voedingsstoffen mineralisatie en afbraak organische materie die voorkomt in de natuur. Enzymen zoals cellobiohydrolase (CBH) en β-glucosidase zijn belangrijk voor degradatie van cellulose en werken samen om de hydrolyse van cellulose tot glucose 1,2, die bruikbaar koolstofsubstraat voor opname en microbiële assimilatie zorgt katalyseren. Het enzym fosfatase releases oplosbare anorganische fosfaatgroepen van organofosfaten, wezen mineralisatie van fosfaat en beschikbaar te maken voor gebruik door de meeste organismen 3. Andere enzymen, zoals N-acetylglucosaminidase (NAGase) zijn important in chitine degradatie en kan zowel koolstof en stikstof beschikbaar voor microbiële overname 4 maken.
Een van de procedures voor de bepaling van microbiële extracellulaire enzymactiviteit in de natuur is het gebruik van kunstmatige p-nitrofenyl (p NP) verbonden substraten, een benadering die oorspronkelijk werd ontwikkeld bodem fosfataseactiviteit 5 detecteren. Deze benadering berust op de detectie van een gekleurd eindproduct, p-nitrofenol, dat vrijkomt wanneer de kunstmatig substraat wordt gehydrolyseerd door het geschikte enzym. De p-nitrofenol kan vervolgens colorimetrisch gekwantificeerd door het meten van de absorptie bij ongeveer 400-410 nm. Deze methode is vervolgens toegepast op andere enzymen zoals NAGase 6 detecteren, en is gebruikt in verschillende onderzoeken naar microbiële extracellulaire enzymactiviteit in bodems en sedimenten 7-9.
Een alternatieve benadering die originall wasy ontwikkeld om extracellulaire glucosidasewerkzaamheid beoordelen in het aquatisch milieu 10,11 maakt gebruik van 4-methylumbelliferon (MUB) gekoppeld substraten. Het eindproduct uitgebracht (4-methylumbelliferon) is sterk fluorescerende en kan worden gedetecteerd met behulp van een fluorometer met een excitatie / emissie instelling rond 360/460 nm. Diverse MUB-gekoppelde kunstmatige substraten zijn, waardoor de fluorometrische meting van de activiteit van ten minste evenveel enzymen (bijv. β-glucosidase, cellobiohydrolase, NAGase, fosfatase) zoals kan worden bepaald met de p NP-substraat colorimetrische werkwijze. Andere microbiële extracellulaire enzymen, zoals eiwit-afbrekende leucine aminopeptidase kan fluorometrisch worden getest met 7-amino-4-methylcumarine (COU) verbonden substraten. Zowel MUB-en COU-gekoppelde substraten zijn gebruikt om enzymactiviteit te bepalen in verschillende terrestrische en aquatische monsters 12,13.
Hoewel eerdere studies hebben descrIBED fluorometrische of colorimetrische microplaat benaderingen van extracellulaire enzymactiviteit 14 te bepalen, er is behoefte aan een duidelijke presentatie van hoe dergelijke tests uit te voeren. Hier laten we procedures voor de high throughput microplaat voor de analyse van extracellulaire enzymactiviteit in bodems en sedimenten met de colorimetrische p-NP verbonden substraten benadering en in natuurlijk water via de fluorescente MUB verbonden substraten techniek. Wij richten ons op de meting van de activiteiten van β-glucosidase, NAGase en fosfatase als deze enzymen respectievelijk kunnen worden gekoppeld aan koolstof, stikstof en fosfor fietsen. Echter, de hier beschreven procedures voor bepaling van andere extracellulaire enzymen met verschillende artificiële substraten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het bepalen van de activiteit van een verscheidenheid van extracellulaire microbiële enzymen in bodems en sedimenten kunnen bruikbare inzichten tarieven voedingsstoffen mineralisatie en organisch materiaal verwerking 17 verschaffen. Echter, kan de bodem variëren in hun vochtgehalte, dus is het belangrijk om te standaardiseren op drooggewicht. Dit vereist een extra droogstap (gewoonlijk twee dagen) dan alleen het meten van enzymactiviteit. Aldus, in tegenstelling tot assays enzymactiviteit in watermonsters d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering voor aspecten van dit werk werd geleverd door verschillende bronnen, waaronder het Amerikaanse ministerie van Landbouw Specifieke samenwerkingsovereenkomst 58-6408-1-595 en de National Science Foundation (award 1.049.911).
Materials
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers |
Referências
- Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -. E. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).
- Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity. Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).
- Dalal, R. C. Soil organic phosphorus. Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).
- Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).
- Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).
- Parham, J. A., Deng, S. P. Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil. Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
- Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem. Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).
- Olander, L. P., Vitousek, P. M. Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability. Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments. Wetlands. 29, 277-287 (2009).
- Hoppe, H. -. G. Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates. Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).
- Somville, M. Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water. Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
- Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and soil. 175, 147-152 (1995).
- Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production. Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).
- Marx, M. -. C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
- Jackson, C. R., Weeks, A. Q. Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis. Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).
- Canion, A. K., Ochs, C. The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi. Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).
- Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).
- Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland. Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp. Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).
- Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest. Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).
- Rietl, A. J., Jackson, C. R. Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).
- Smart, K. A., Jackson, C. R. Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain. Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).
