تقرير من خارج الخلية الميكروبية نشاط انزيم في المياه، والتربة، والرواسب باستخدام إنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية فحوصات
Summary
ووصف الإجراءات صفيحة ميكروسكوبية استنادا لتحليل اللونية أو فلوروميتريك من نشاط انزيم خارج الخلية. تسمح هذه الإجراءات للفحص السريع للنشاط من هذا القبيل في أعداد كبيرة من العينات البيئية ضمن إطار زمني يمكن التحكم فيها.
Abstract
الكثير من تدوير المغذيات وتجهيز الكربون في البيئات الطبيعية يحدث من خلال نشاط الانزيمات خارج الخلية الصادرة عن الكائنات الحية الدقيقة. وبالتالي، يمكن قياس نشاط هذه الانزيمات خارج الخلية تعطي نظرة ثاقبة معدلات العمليات مستوى الأنظمة الإيكولوجية، مثل التحلل المواد العضوية أو النيتروجين والفوسفور تمعدن. المقايسات من نشاط انزيم خارج الخلية في العينات البيئية تنطوي عادة تعريض عينات لركائز اللونية أو فلوروميتريك الاصطناعي وتتبع معدل الركيزة التحلل. نحن هنا تصف أساليب صفيحة ميكروسكوبية استنادا لهذه الإجراءات التي تسمح للتحليل عدد كبير من العينات في غضون فترة زمنية قصيرة. ويسمح للعينات لتتفاعل مع ركائز الاصطناعي خلال 96 جيدا microplates أو بئر عميقة كتل صفيحة ميكروسكوبية، ويتم تحديد نشاط انزيم في وقت لاحق عن طريق امتصاص أو مضان من المنتج النهائي مما أدى باستخدام صفيحة ميكروسكوبية ريد نموذجيةص أو التألق. هذه الإجراءات إنتاجية عالية ليس فقط تسهيل المقارنات بين المواقع أو النظم الإيكولوجية منفصلة مكانيا، ولكن أيضا تخفيض كبير في تكلفة هذه المقايسات من خلال تقليل كميات كاشف الشاملة المطلوبة لكل عينة.
Introduction
الكائنات الدقيقة مثل البكتيريا والفطريات الحصول على المواد الغذائية والكربون من المركبات العضوية المعقدة من خلال إنتاج إنزيمات خارج الخلية. هذه الإنزيمات عادة يتحلل البوليمرات في مفارز الصغيرة التي يمكن اتخاذها في الخلية. لذلك، على المستوى البيئي، وهذه الانزيمات خارج الخلية الجرثومية هي المسؤولة عن الكثير من تمعدن المواد الغذائية وتحلل المواد العضوية التي تحدث في البيئات الطبيعية. الانزيمات مثل cellobiohydrolase (CBH) وβ جلوكوزيد مهمة لتدهور السليلوز والعمل في انسجام لتحفيز التحلل من السليلوز إلى جلوكوز 1،2، الذي يوفر ركيزة للاستعمال الكربون لامتصاص الميكروبية والاستيعاب. انزيم الفوسفاتيز تطلق مجموعات الفوسفات غير العضوية القابلة للذوبان من الفوسفات العضوية، التمعدن أساسا الفوسفات وجعلها متاحة للاستخدام من قبل معظم الكائنات الحية 3. الأنزيمات الأخرى، مثل N-acetylglucosaminidase (ناغاسي)، ومهمر في تدهور الكيتين ويمكن أن تجعل كلا من الكربون والنيتروجين المتاحة لاكتساب الجراثيم 4.
واحدة من إجراءات الفحص من نشاط انزيم الميكروبية خارج الخلية في البيئات الطبيعية هو استخدام الاصطناعي البارانتروفنيل (ع NP) ركائز مرتبطة، وهو النهج الذي وضعت أصلا للكشف عن نشاط إنزيم الفوسفاتيز التربة 5. يعتمد هذا النهج على الكشف عن المنتج النهائي الملونة، ف نيتروفينول، والتي يتم تحريرها عندما يتم تحلل الركيزة الاصطناعي بواسطة انزيم المناسبة. للنيتروفينول ع يمكن قياسها كميا في وقت لاحق من خلال قياس الامتصاصية colorimetrically لها في حوالي 400-410 نانومتر. ومنذ ذلك الحين تم تطبيق هذه الطريقة للكشف عن إنزيمات أخرى مثل ناغاسي 6، واستخدمت في دراسات مختلفة تبحث في نشاط انزيم الميكروبية خارج الخلية في التربة والرواسب 7-9.
النهج البديل الذي كان اصلاوضعت ذ لتقييم النشاط جلوكوسيديز خارج الخلية في البيئات المائية 10،11 يجعل من استخدام 4 methylumbelliferone (MUB) ركائز المرتبطة. المنتج النهائي سراح (4 methylumbelliferone) هو الفلورسنت للغاية ويمكن الكشف عن ذلك باستخدام مقياس التألق مع أجواء الإثارة / الانبعاثات حوالي 360/460 نانومتر. هي مجموعة متنوعة من ركائز اصطناعية MUB مرتبطة المتاحة، والسماح قياس فلوروميتريك لنشاط ما لا يقل عن العديد من الإنزيمات (مثل β جلوكوزيد، cellobiohydrolase، ناغاسي، الفوسفاتيز) كما يمكن أن يعاير باستخدام ف NP الركيزة الإجراء اللونية. الانزيمات خارج الخلية الميكروبية الأخرى، مثل البروتين المهينة يسين أمينوببتيداز، يمكن أن يعاير fluorometrically باستخدام 7-الأمينية-4-methylcoumarin (كال) ركائز المرتبطة. وقد استخدمت كل من MUB وركائز كال المرتبطة لتحديد نشاط انزيم في مختلف العينات الأرضية والمائية 12،13.
بينما الدراسات السابقة لها descrنهج ibed صفيحة ميكروسكوبية فلوروميتريك أو اللونية لتحديد نشاط انزيم خارج الخلية 14، وليس هناك حاجة لتقديم عرض واضح لكيفية إجراء مثل هذه المقايسات. نحن هنا لشرح الإجراءات لإجراء تقنيات عالية الإنتاجية صفيحة ميكروسكوبية لتحليل نشاط انزيم خارج الخلية في التربة والرواسب باستخدام النهج ص ركائز مرتبطة NP اللونية في المياه الطبيعية وباستخدام تقنية ركائز MUB المرتبطة الفلورسنت. ونحن نركز على قياس أنشطة β جلوكوزيد، ناغاسي، والفوسفاتيز وهذه الأنزيمات يمكن أن تكون مرتبطة إلى الكربون، والنيتروجين، والفوسفور وركوب الدراجات، على التوالي. ومع ذلك، فإن الإجراءات المذكورة هنا يمكن تطبيقها على قياس الانزيمات خارج الخلية الأخرى باستخدام ركائز اصطناعية مختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن تحديد النشاط من مجموعة متنوعة من الانزيمات خارج الخلية الجرثومية في التربة والرواسب توفير معلومات مفيدة في معدلات تمعدن المواد الغذائية ومعالجة المواد العضوية 17. ومع ذلك، يمكن التربة تختلف في مستويات الرطوبة، لذلك فمن المهم لتوحيد النشاط على التربة الوز…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقدمت التمويل لجوانب هذا العمل من مختلف المصادر بما في ذلك الولايات المتحدة وزارة الزراعة الاتفاق التعاوني النوعي 58-6408-1-595 والمؤسسة الوطنية للعلوم (الجائزة 1049911).
Materials
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers |
Referências
- Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -. E. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).
- Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity. Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).
- Dalal, R. C. Soil organic phosphorus. Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).
- Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).
- Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).
- Parham, J. A., Deng, S. P. Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil. Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
- Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem. Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).
- Olander, L. P., Vitousek, P. M. Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability. Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments. Wetlands. 29, 277-287 (2009).
- Hoppe, H. -. G. Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates. Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).
- Somville, M. Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water. Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
- Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and soil. 175, 147-152 (1995).
- Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production. Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).
- Marx, M. -. C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
- Jackson, C. R., Weeks, A. Q. Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis. Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).
- Canion, A. K., Ochs, C. The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi. Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).
- Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).
- Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland. Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp. Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).
- Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest. Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).
- Rietl, A. J., Jackson, C. R. Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).
- Smart, K. A., Jackson, C. R. Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain. Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).
