العزلة، معالجة وتحليل خلايا اللثة الفئران
Summary
توضح هذه الدراسة تقنية فعالة لعزل ومعالجة أنسجة اللثة من تجويف الفم الماوس من أجل إنتاج ثقافة وحيدة الخلية. الخلايا الناتجة يمكن استخدامها كذلك لتحليل التدفق الخلوي والدراسات الجزيئية.
Abstract
لقد قمنا بتطوير تقنية لعزل بدقة ومعالجة الأنسجة اللثوية الفئران لالتدفق الخلوي والدراسات الجزيئية. اللثة هي النسيج فريدة وهامة لدراسة آليات المناعة لأنها تشارك في الاستجابة المناعية المضيف ضد بيوفيلم عن طريق الفم التي قد تسبب أمراض اللثة. وعلاوة على ذلك، وعلى مقربة من اللثة إلى أنسجة العظم السنخي تمكن تدرس أيضا إعادة تشكيل العظام في ظل ظروف التهابات. لدينا وسيلة تعطي كمية كبيرة من الخلايا المناعية التي تتيح تحليل حتى السكان الخلية نادرة مثل خلايا لانغرهانس وخلايا T التنظيمية كما أثبتنا سابقا 1. الفئران التي تستخدم لدراسة الاستجابات المناعية المحلية المعنية في فقدان العظم السنخي خلال أمراض اللثة هو مفيد بسبب توافر مختلف الأدوات المناعية والتجريبية. ومع ذلك، نظرا لصغر حجم وغير مريح نسبيا الوصول إلى اللثة الفئران، تجنب العديد من الدراسات دراسة ثيق الحرجة في الأنسجة. الطريقة الموضحة في هذا العمل يمكن أن تسهل تحليل اللثة، التي نأمل زيادة التفاهم لدينا على الجهاز المناعي عن طريق الفم ودورها خلال أمراض اللثة.
Introduction
اللثة هي الأنسجة الرخوة المحيطة عنق الرحم جزء من الأسنان ويغطي عملية السنخية (الشكل 1). اللثة هو نوع من الغشاء المخاطي المضغ التي يمكن تقسيمها إلى مزيد من ظهارة الغشاء المخاطي والنسيج الضام (المعروف أيضا باسم مخاطية أو الصفيحة المخصوصة). بنية التشريحية للاللثة والأسنان المجاورة يسمح البكتيريا للإقامة وتطوير لوحة (بيوفيلم) التي تتحدى باستمرار الجهاز المناعي المحلية. ونتيجة لذلك، يطور الاستجابة الالتهابية في اللثة، والتي في ظروف معينة يصبح المدمرة – وهي حالة تسمى أمراض اللثة 2. في الأساس، ويمكن تقسيم أمراض اللثة البلاك التي يسببها التهاب اللثة والتهاب اللثة إلى. التهاب اللثة يمثل حالة عكسها من الاستجابة الالتهابية المحلية أن يقتصر على اللثة. التهاب اللثة، من ناحية أخرى، هو عملية تدميرية لا رجعة فيه جهاز مرفق (العظم السنخي، اللثةيتم تدمير الرباط، الملاط واللثة) 3.
واقترح اللثة لخدمة المواقع على حد سواء المستجيب كما وحثي خلال أمراض اللثة 4. وقد اقترحت الدراسات أن الإنسان استجابة لوحة الأسنان، وخلايا المستجيب المناعي والجزيئات تسللت بشكل حيوي أو مغادرة اللثة 5-7. وقد تبين هذا النشاط لتلعب دورا رئيسيا في تدمير اللثة 8،9. في حين البيانات التي تولدها هذه الدراسات قدمت معلومات قيمة بخصوص هذه العملية المرضية، والعمل مع الأنسجة البشرية تمتلك القيود الأخلاقية والتقنية والتجريبية الكبرى. تطوير نماذج تجريبية يسمح التجريب السبب والنتيجة عبر استخدام الفئران المعدلة وراثيا والتدخلات في الجسم الحي 10. ونتيجة لذلك، علمنا على الآليات التي تشارك في أمراض اللثة زيادة كبيرة خلال العقدين الماضيين. وحتى مع ذلك، ونظرا لتعقيد أمراض اللثة، وهناكمناقشة جارية بشأن طبيعة الاستجابة المناعية المحلية تسهيل تدمير الأنسجة. هناك أيضا نقص في فهمنا على وظيفة الخلايا المناعية المركزية في اللثة أثناء أمراض اللثة. وبالتالي فمن الضروري دراسة الأحداث التهابات المرضية التي تحدث في النسيج المستهدف لهذا المرض، واللثة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الفك العلوي أنسجة اللثة الحصول عليها من ماوس واحدة كافية لتحليل المجموعات الفرعية من السكان من الخلايا الليمفاوية T و B، وكذلك قدرتها على التعبير عن جزيئات الخلية وبين الخلايا كما وصفنا سابقا 1. ومع ذلك، إذا السكان الخلية نادرة ذات أهمية (على سبيل المثال ن)، فمن ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم إسرائيل (رقم 1418/11) لآه و(رقم 1933-1912) إلى AW، ومؤسسة الإسرائيلية الألمانية للمحققين الشباب (GIF يونغ) إلى الخبر، وأنا د. . صندوق الهبات للبحوث Cabakoff في مدرسة الجامعة العبرية هداسا طب الأسنان لآه وAW.
Materials
| Comments (optional) | Catalogue number | Company | Name of the reagent |
| CLS-2 | Worthington Biochemical Corp. | Collagenase Type II | |
| DN25-1G | SIGMA | DNAse I | |
| E6758-100G | SIGMA | EDTA | |
| D8537 | SIGMA | Dulbecco’s PBS | |
| Heat Inactivated | 04-121-1 | Biological Industries | Fetal Bovine Serum |
| FPE-204-500 | Jet Biofil | Vacuum-Driven Filter | |
| 352052 | BD Falcon | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | |
| 93070 | SPL Lifesciences | Cell Strainer 70 μm | |
| 153066 | NUNC | Tissue Culture Dish 35×10 mm | |
| 554714 | BD | BD Cytofix/Cytoperm | |
| Clone N418 | 117305 | Biolegend | Anti-mouse CD11c antibody |
| Clone 104 | 109819 | Biolegend | Anti-mouse CD45.2 antibody |
| Clone GK1.5 | 100413 | Biolegend | Anti-mouse CD4 antibody |
| Clone 53-6.7 | 100733 | Biolegend | Anti-mouse CD8a antibody |
| Clone 17A2 | 100214 | Biolegend | Anti-mouse CD3 antibody |
| Clone G8.8 | 118219 | Biolegend | Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody |
| Clone 929F3.01 | DDX0362D | Imgenex | Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody |
| Clone 39-10-8 | 115010 | Biolegend | Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody |
| BD Biosciences | LSR II Flow Cytometer | ||
| Tree Star | FlowJo Software v 7.6.5 |
Referências
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A. Pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
