Radicaal gebaseerde biomimetische chemie werd toegepast op opbouw libraries nodig biomarkerontwikkeling.
De betrokkenheid van vrije radicalen in de biowetenschappen voortdurend toegenomen met de tijd en is aangesloten op een aantal fysiologische en pathologische processen. Dit onderwerp omvat diverse wetenschappelijke gebieden, variërend van fysische, biologische en bio-organische chemie biologie en geneeskunde, met toepassingen in de verbetering van de kwaliteit van leven, gezondheid en veroudering. Multidisciplinaire vaardigheden zijn vereist voor het volledig onderzoek van de vele facetten van de radicale processen in de biologische omgeving en chemische kennis speelt een cruciale rol in de onthulling van fundamentele processen en mechanismen. We ontwikkelden een chemische biologie aanpak, waarmee vrije radicalen chemische reactiviteit verbinden met biologische processen, het verstrekken van informatie over de mechanistische paden en producten. De kern van deze benadering is het ontwerp van biomimetische modellen biomolecule gedrag (lipiden, nucleïnezuren en eiwitten) bestuderen in waterige systemen verkrijgen inzichten van de reactieroutes en eens opbouw moleculaire bibliotheken van de vrije radicalen reactieproducten. Deze context kan succesvol gebruikt worden voor biomerkers en voorbeelden zijn voorzien van twee soorten verbindingen: mono-trans isomeren van cholesteryl esters die worden gesynthetiseerd en gebruikt als referentie voor de detectie in menselijk plasma en purine 5 ',8-cyclo-2 '-deoxyribonucleosides, bereid en gebruikt als referentie in het protocol voor detectie van dergelijke laesies in DNA monsters na ioniserende straling of verkregen uit verschillende gezondheidsproblemen.
De reactiviteit van vrije radicalen bleek zijn enorme belang voor vele biologische gebeurtenissen, waaronder veroudering en ontstekingen. Tegenwoordig is steeds duidelijker dat de opheldering van elke chemische stap bij deze reactiviteit nodig is om de onderliggende mechanismen te begrijpen en te overwegen effectieve strategieën voor de bestrijding van vrije radicalen en herstel van de schade. De bijdrage van chemisch onderzoek is van fundamenteel belang, maar de directe studie in de biologische omgeving kan moeilijk zijn, omdat de superpositie van verschillende processen bemoeilijkt en verstoort het onderzoek van de resultaten en de conclusies. Daarom is de strategie van het modelleren van reacties van vrije radicalen onder biologisch verwante omstandigheden uitgegroeid tot een fundamentele stap in het onderzoek van de chemische mechanismen in de biologie.
In het laatste decennium onze groep modellen van vrije radicalen processen ontwikkeld onder biomimetische omstandigheden. We en met namevisaged biologisch relevante veranderingen van onverzadigde vetzuren, nucleosiden en zwavelhoudende aminozuren en zet ze in het spoor te evalueren en gevalideerd als biomarkers van de gezondheidstoestand. 1-4
Onze algemene aanpak bestaat uit drie modules:
We kozen twee klassen relevante biomarkers deze benadering erkennen: cholesterylesters en purine 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides.
De omzetting van natuurlijke cis onverzadigde vetzuren tot geometrische isomeren trans is een transformatie op de productie van radicalen stress in de biologische omgeving. Celmembraanlipiden, die vetzuren bevatten, een relevant biologisch doelwit voor radicale stress en we onderzocht eerst de endogene cis-trans isomerisatie fosfolipiden in celkweken, dieren en mensen beoordelen analytische protocollen deelneemt. 8-10 We hebben aangetoond dat deze transformatie kan optreden door diverse S-bevattende verbindingen, zoals thiolen, thioethers en disulfiden die onder verschillende radicalen stress omstandigheden kunnen thiyl radicalen genereren, namelijk de isomerisatie agent (Figuur 3). Het voorbeeld in dit artikel staat de klasse van cholesteryl esters, die een bekende fractie van plasmalipiden strikt betrokken lipoproteïnemetabolisme vertegenwoordigen. De esterbinding tussen vetzuren en cholesterol wordt gebiosynthetiseerd door de overdracht van vetzuren uit de positie 2 van het glycerol deel van fosfatidylcholine cholesterol, een stap gekatalyseerd door het enzym lecithine cholesterol acyl transferase (LCAT). Daarom zijn plasma cholesterylesters nauw verbonden met turnover en bevatten relatief hoog gehalte aan meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA) typisch aanwezig in fosfatidylcholinen, zoals linolzuur en arachidonzuur zuren. Lipoproteïne vorming is betrokken bij cardiovasculaire en metabole ziekten. De reactiviteit van natuurlijke cholesteryl esters met vrije radicalen kunnen op de dubbele bindingen van linoleaat en arachidonaat resten die kunnen worden omgezet in de overeenkomstige trans geometrische isomeren (zie Figuur 1 voor de structuur). Karakterisering van de trans cholesterylester gehalte in biologische monsters is interessant voor biomarkerontwikkeling. Een indirecte methode bestaat uit de transformatie van cholesteryl esters geïsoleerd uit plasma met de overeenkomstige vetzuurmethylesters (FAME) en scheiding door gaschromatografische protocollen. In dit geval wordt de kalibratie van de referenties van cis en trans fatty acid methyl esters uitgevoerd om de kwantificering van de trans-gehalte in de monsters mogelijk. Gebaseerd op de analytische studies op het cholesterylester bibliotheek uitgevoerd, stelden wij eveneens een methode waarbij Raman spectroscopie, kunnen worden die rechtstreeks op de cholesterylester fractie geïsoleerd uit plasma, zonder verdere derivatisering op de overeenkomstige FAME (zie figuren 2 pt 9). Het is vermeldenswaard dat tot nu toe geen succesvolle werkwijzen beschreven om afzonderlijke cis en trans isomeren van vetzuren bevattende lipiden door HPLC zoals beschreven in plaats cholesteryl ester hydroperoxiden. Tot nu toe, de indirecte gaschromatografische methode is nog steeds de beste beschikbare methode tot nu toe. Door deze werkwijze wordt de eerste kwantitatieve evaluatieatie van de mono-trans dat afkomstig is van cholesteryl esters geïsoleerd uit plasma van gezonde personen werd verstrekt. Met vlamionisatiedetector (FID) het maximum van detecteerbaarheid bevredigend (ppb) en nanomolaire hoeveelheden van de verbindingen zijn vastgesteld. 5. Met verschillende detectiesystemen deze limiet kan zelfs worden verlaagd. Het effect van ioniserende straling op cholesterylesters is kwestie van verder onderzoek, of een lineaire respons ten opzichte van de toegediende dosis verkregen.
Als tweede voorbeeld kozen we gemodificeerde nucleosiden kan worden door vrije radicalen van DNA. Hydroxylradicalen (HO •) is bekend dat de meest schadelijke reactieve zuurstof species (ROS) voor hun vermogen om chemische wijzigingen veroorzaken DNA. Enkele of meerdere laesies voorkomen op DNA dat in eukaryote cellen is gelegen in kern en mitochondria. Identificatie en meting van de belangrijkste klassen van oxidatieve schade aan DNA gegenereerd vereisen approprIATE moleculaire bibliotheken om het opzetten van de analytische protocollen. We concentreerden ons belang op de kleinste tandem laesies, die purine 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, met een aanvullende covalente binding tussen de basis en de suikergroepen die door de vrije radicalen. De verbindingen zijn 5 ',8-cyclo-2'-deoxyadenosine en 5 ',8-cyclo-2'-deoxyguanosine die in de 5'R en 5'S diastereomere vormen (Figuur 5). Hun vermogen om vrije radicalen stress marker geworden is van fundamenteel onderzoek. Twee Inderdaad, als DNA wordt blootgesteld aan HO • radicaal waterstofabstractie van positie C5 "van de suiker is een van de mogelijke gebeurtenissen die leiden tot de vorming van deze laesies tandem. Purine 5 ',8-cyclonucleosides kan worden gemeten som van diastereomeren door HPLC-MS/MS in enzymatisch gedigereerd γ-bestraalde DNA monsters variërend 1 tot 12 laesies / 10 6 nucleosiden / Gy gaat vorm afwezigheid van zuurstof fysiologische zuurstofgehalte ikn weefsels, de diastereomere verhouding 5'R / 5 wezen ~ 4 ~ en 3 voor 5 ',8-cdAdo en 5' ,8-cdGuo respectievelijk (Figuur 11). 11 Het is vermeldenswaard dat de relatie tussen stralingsdosis en 5 ',8-cdAdo en 5' ,8-cdAdo laesies in cellulair DNA verre van begrepen. De enkel experiment gebaseerd op 2kGy bestraling vermeld in het experimentele niet afdoende worden beschouwd. 11 Verdere experimenten dergelijke en analytische kwantificering van de vier laesies worden genomen voor deze verhouding. De detectie van deze laesies en de meer populaire oxidatieve transformaties (zoals 8-oxo-2'-deoxyguanosine, 8-oxodGuo) zijn enkele intense onderzoeken, waaruit het belang van beide lesies gedurende oxidatieve metabolisme. 6,13 Het gebruik van HPLC -MS/MS (triple quadrupole) een detectiegrens nabij 30fmol voor alle vier laesies. Laatst verbeteringen wordt beweerd dat detectiegrenzen van attomol niveaus te bereiken door het instrument produproducenten. Gebaseerd op de recente literatuur, 6 analytische procedures moeten de juiste opruiming van het monster en verrijking omvatten om de detectielimieten van de MS / MS / MS (ion trap) of de MS / MS (triple quadrupole) gebruikt, voldoen in ons geval.
Bio-geïnspireerde synthetische procedures van verbindingen 1-4 werden ontwikkeld vanuit 8-bromopurine derivaten onder of fotolyse. 7,12 Deze procedures omvatten een groep cascade reactie die de DNA schade vormingsmechanisme van 5 nabootst ',8-cdAdo en 5' ,8-cdGuo laesies. Van biologische perspectieven, bleek dat deze beschadigingen ophopen rijping in een weefsel-specifieke wijze (lever> nieren> hersenen), aan te tonen dat DNA herstelmechanismen niet volstaan om het genetisch materiaal behoeden deze laesies. 13 immers nucleotide excision repair (NER) is de enige weg die momenteel aan de reparatie van deze laesies. twee
De twee klassees van verbindingen getoond in figuren 1 pt 5 zijn niet commercieel beschikbaar op dit moment echter door de synthetische strategieën beschreven in de literatuur niet moeilijk deze verbindingen te bereiden voor commercieel gebruik.
De multidisciplinaire aanpak die door chemische biologie studies heeft niet alleen een enorme waarde in de identificatie van nieuwe mechanismen die zich in de biologische omgeving, maar geeft ook een fundamentele bijdrage aan de ontdekking van biomarkers en diagnostiek, uiteindelijk brengen nieuwigheid in de gezondheidszorg en preventie strategieën. 14 De chemische bijdrage nodig is voor een succesvolle ontwikkeling van de moleculaire geneeskunde, het creëren van geïntegreerde platforms en panels voor metabool profiel die naar verwachting zorgen voor een optimale rationalisering van interventie ontwerp, hetzij therapeutische en voedingswaarde, het verminderen van de onzekerheden en mislukkingen als ze kunnen zijn voorspelbaar.
The authors have nothing to disclose.
Financiële steun van de Ministero dell'Istruzione, dell'Universita della Ricerca (PRIN-2009K3RH7N_002) en Marie Curie Intra-European Fellowship (CYCLOGUO-298555) en de sponsoring van COST-actie CM0603 op 'Free Radicals in Chemical Biology en COST Actie CM1201 op "Biomimetic Radical Chemistry" worden bedankt.
MATERIALS | |||
Cholesteryl linoleate ≥98% | Sigma-Aldrich | C0289-100 mg | |
Cholesteryl arachidonate≥95% | Sigma-Aldrich | C8753-25mg | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100 ml | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | |
Methanol 215 SpS | Romil | H409-2,5 L | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
Chloroform SpS | Romil | H135 2,5 L | |
n-Hexane 95% SpS | Romil | H389 2,5 L | |
Acetonitrile 230 SpS | Romil | H047 2,5 L | |
Dichloromethane SpS | Romil | H2022,5 L | |
Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 107344-1L | |
Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966-1L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
NaOH solid | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
NH4OH sol. 28%-30% | Sigma-Aldrich | 221228-1L-A | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | |
Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride | Sigma-Aldrich | 221759-100G | |
Ammonium Molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302-100G | |
Sulfuric Acid 95%-98% | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | 209139-25G | |
Sodium sulfate anhydrous | Sigma-Aldrich | 238597-500G | |
Nuclease P-I from penicillium citrinum | Sigma-Aldrich | N8630-1VL | |
Phosphodiesterase II type I-sa | Sigma-Aldrich | P9041-10UN | |
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc | Sigma-Aldrich | E114-25MG | |
Phosphatase alkaline type VII-t from*bov | Sigma-Aldrich | P6774-1KU | |
Phosphodiesterase I type VI | Sigma-Aldrich | P3134-100MG | |
Deoxyribonuclease II type IV from*porcin | Sigma-Aldrich | D4138-20KU | |
Trizma(r) base, biotechnology performanc ce | Sigma-Aldrich | T6066-100G | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644-100G | |
Succinic acid bioxtra | Sigma-Aldrich | S3674-250G | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670-100G | |
Formic acid, 98 % | Sigma-Aldrich | 06440-100ML | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Millipore | UFC500324 | |
8-Bromo-2′-deoxyguanosine | Berry & Associates | PR3290-1 g | |
8-Bromo-2′-deoxyadenosine | Berry & Associates | PR3300-1 g | |
Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
2′-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3899-CA-0.1 | |
2′-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3895-0.1 | |
Nitrous oxide (N2O) | Air Liquide | ||
Deoxyribonucleic acid from calf thymus | Sigma Aldrich | D4522-5MG | |
EQUIPMENT | |||
60Co-Gammacell | AECL- Canada | 220 | |
Immersion well reaction medium pressure 125 watts | Photochemical reactors ltd | Model 3010 | |
Evaporating flask 250 ml | Heidolph | P/N NS 29/32 514-72000-00 | |
Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm | Phenomenex | 00A-4252-E0 | |
Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm | Grace | 88081 | Semipreparative |
SecurityGuard Kit | Phenomenex | KJ0-4282 | Analytical holder kit and accessories |
Holder for 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7220 | Semipreparative holder |
10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7221 | |
High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1100 | |
LC/MS/MS | Applied Biosystems | 4000QTRAP System | |
Tandem mass ESI spectrometer | (Bruker Daltonics) | Esquire 3000 plus | |
Vial 2-4 ml | SUPELCO | Cod 27516 | |
Vial 4 ml | SUPELCO | Cod 27517 |