Radikal-baseret biomimetisk kemi er blevet anvendt på opbygning biblioteker er nødvendige for biomarkør udvikling.
Inddragelsen af frie radikaler i biovidenskab vokset konstant med tiden og er blevet forbundet med flere fysiologiske og patologiske processer. Dette emne omfatter forskellige videnskabelige områder, der spænder fra fysiske, biologiske og bioorganisk kemi til biologi og medicin, med ansøgninger til forbedring af livskvalitet, sundhed og aldring. Tværfaglige færdigheder er nødvendige for den fulde undersøgelse af de mange facetter af radikale processer i det biologiske miljø og kemiske viden spiller en afgørende rolle i afsløringen grundlæggende processer og mekanismer. Vi udviklede et kemisk biologi tilgang stand til at forbinde fri radikal kemisk reaktivitet med biologiske processer, der giver oplysninger om de mekanistiske veje og produkter. Kernen i denne fremgangsmåde er udformningen af biomimetiske modeller til at studere biomolekyle adfærd (lipider, nukleinsyrer og proteiner) i vandige systemer, opnå indsigt i reaktionsveje samt ens opbygning af molekylære biblioteker af fri-radikal reaktionsprodukter. Denne forbindelse kan med succes anvendes til biomarkør opdagelse og eksempler er tilvejebragt med to klasser af forbindelser: mono-trans-isomerer af cholesterylestere, som syntetiseres og anvendes som reference til påvisning i humant plasma, og purin 5 ',8-cyclo-2 «-deoxyribonucleosider, fremstilles og anvendes som reference i protokollen for påvisning af sådanne læsioner i DNA-prøver, efter ioniserende stråling eller indhentet fra forskellige helbredsproblemer.
Reaktiviteten af frie radikaler afslørede sin enorme betydning for mange biologiske begivenheder, herunder aldring og inflammation. I dag er det mere og mere tydeligt, at en afklaring af hvert kemikalie trin involveret i denne reaktivitet er behov for, for at forstå de underliggende mekanismer og der fremsættes effektive strategier til bekæmpelse af frie radikaler og reparation af skaderne. Bidraget fra kemiske undersøgelser er fundamental, men den direkte undersøgelse i det biologiske miljø kan være svært, da overlejring af forskellige processer vanskeliggør og foruroliger gennemgangen af resultaterne og de dertil knyttede konklusioner. Derfor har strategien med at modellere frie radikaler reaktioner under biologisk beslægtede forhold bliver et afgørende skridt i forskningen af kemiske mekanismer i biologi.
I det sidste årti vores gruppe udviklede modeller af frie radikaler processer under biomimetiske betingelser. I særdeleshed har vi davisaged biologisk relevante transformationer af umættede fedtsyrer, nukleosider og svovlholdige aminosyrer og læg dem i det spor, der skal evalueres og valideres som biomarkører for sundhedstilstanden. 1-4
Vores generelle tilgang består af tre moduler:
Vi valgte to klasser af relevante biomarkører at godkende denne fremgangsmåde: cholesterylestere og purin 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosider.
Omdannelsen af naturligt forekommende cis-umættede fedtsyrer til geometriske trans-isomerer er en transformation forbundet med produktionen af radikal stress i det biologiske miljø. Cellemembran-lipider, der indeholder fedtsyrer, er en relevant biologisk mål for radikal stress og vi først undersøgt det endogene cis-trans phospholipider isomerisering i cellekulturer, dyr og mennesker vurdering analysemetoderne i hvert tilfælde. 8-10 Vi viste, at denne transformation kan ske ved en række S-holdige forbindelser, herunder thioler, thioethere og disulfider, der under forskellige radikal stressbetingelser er i stand til at generere thiyl grupper, dvs isomerisering middel (figur 3). Eksemplet vist i denne artikel fokuserer på klassen af cholesterylestere, som repræsenterer en kendt brøkdel af plasmalipider, nøje involveret i lipoproteinmetabolismen. Esterbindingen mellem fedtsyrer og cholesterol biosyntetiseres ved overførsel af fedtsyrer fra 2-positionen i glyceroldelen af phosphatidylcholin og cholesterol, et trin katalyseret af enzymet lecithin cholesterol acyl transferase (LCAT). Derfor er plasma cholesterylestere nøje forbundet med membranlipid omsætning, og indeholder relativt store andele af polyumættede fedtsyrer (PUFA) typisk til stede i phosphatidylcholiner, dvs linol-og arachidonsyre syrer. Lipoprotein formation er involveret i kardiovaskulære og metaboliske sygdomme. Reaktiviteten af naturlige cholesterylestere med frie radikaler kan forekomme ved dobbeltbindingerne af linoleat og arachidonat rester, som kan transformeres i de tilsvarende trans-geometriske isomerer (se figur 1 for de strukturer). Karakterisering af det transeuropæiske cholesterylester indhold i biologiske prøver, er interessant for biomarkør udvikling. En indirekte metode består af omdannelse af cholesteryl estere isoleret fra plasma til de tilsvarende fedtsyremethylestere (FAME) og adskillelse ved gaschromatografisk protokoller. I dette tilfælde er justeringen af standardreferenceværker af cis-og trans fedtsyremethylestere udføres, for at muliggøre kvantificering af trans-indhold i prøverne. Ud fra de analytiske undersøgelser på cholesterylester biblioteket, foreslog vi at anvende også en metode baseret på Raman spektroskopi, som kan udføres direkte på cholesterylester fraktionen isoleret fra plasma uden yderligere derivatisering til den tilsvarende FAME (se figur 2 og 9). Det er værd at bemærke, at indtil nu ikke succesrige fremgangsmåder er beskrevet at separere cis-og trans-isomerer af fedtsyrer indeholdende lipider ved HPLC, som i stedet beskrevet af cholesterylester hydroperoxider. Hidtil har den indirekte gaschromatografiske metode er stadig den bedst tilgængelige metode hidtil. Ved denne fremgangsmåde den første kvantitativ evalueringtion af mono-trans-indhold afledt af cholesterylestere isoleret fra plasma fra raske forsøgspersoner blev leveret. Ved hjælp flammeionisationsdetektor (FID) grænsen for påviselighed er tilfredsstillende (ppb) og nanomolære mængder af forbindelserne er påvist. Fem. Med forskellige detektionssystemer denne grænse kan endda sænket. Virkningen af ioniserende stråling på cholesterylestere er tale om yderligere undersøgelser, om en lineær respons opnås i forhold til den påførte dosis.
Som et andet eksempel, valgte vi modificerede nucleosider, som kan fremstilles ved fri radikal-beskadigelse af DNA. Hydroxylradikaler (HO •) er kendt for at være de mest skadelige Reactive Oxygen Species (ROS) for deres evne til at forårsage kemiske modifikationer til DNA. Enkelte eller multiple læsioner kan forekomme på DNA, der i eukaryote celler er placeret i kernen og mitochondrier. Identifikation og måling af de vigtigste klasser af oxidative genererede skader på DNA kræver approprIATE molekylære biblioteker med henblik på at etablere de analytiske protokoller. Vi fokuserede vores interesse på de mindste tandem læsioner, som er purin-5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonukleosider, der har en yderligere kovalent binding mellem basen og sukkergrupper skabt af den fri radikal-angreb. Forbindelserne er 5 ',8-cyclo-2'-deoxyadenosin og 5',8-cyclo-2'-deoxyguanosin eksisterer i 5'R og 5'S diastereomere former (figur 5). Deres potentiale til at blive fri radikal stress markør er tale om grundforskning. 2 Faktisk, når DNA bliver udsat for HO • radikal hydrogenfjernelse fra C5-stillingen af sukkeret er en af de mulige begivenheder, der førte til dannelsen af disse tandem læsioner. Purin 5 ',8-cyclonucleosides kan måles som summen af diastereomerer ved HPLC-MS/MS i enzymatisk fordøjet γ-bestrålede DNA-prøver varierer fra 1 til 12 læsioner / 10 6 nukleosider / Gy vil formular fravær af oxygen til fysiologisk niveau af oxygen Jegn væv, det diastereomere forhold 5'R / 5'S bliver ~ 4 og ~ 3 for 5 ',8-cdAdo og 5' ,8-cdGuo henholdsvis (figur 11). 11 Det er værd at bemærke, at forholdet mellem strålingsdosis og 5 ',8-cdAdo og 5' ,8-cdAdo læsioner påvist i cellulært DNA er langt fra forstået. Den enkelt eksperiment baseret på 2kGy bestråling rapporteret i det eksperimentelle kan anses for usikker. 11 Yderligere forsøg af denne art og analytisk mængdebestemmelse af de fire læsioner er nødvendige for at fastlægge denne forbindelse. Påvisningen af disse læsioner, og de mere populære oxidative omdannelser (såsom 8-oxo-2'-deoxyguanosin, 8-oxodGuo) er spørgsmål om intense undersøgelser, der dokumenterer betydningen af begge læsioner ved oxidativ metabolisme. 6,13 Anvendelsen af HPLC -MS/MS (tripel kvadrupol) har en detektionsgrænse tæt på 30fmol for alle fire læsioner. Sidste forbedringer hævdes at nå påvisningsgrænser attomol niveauer af instrumentets produproducenter. Baseret på den meget nyere litteratur, har 6 analysemetoder, der omfatter en korrekt oprydning af prøven og berigelse for at opfylde påvisningsgrænserne for den MS / MS / MS (ionfælde) eller af den anvendte MS / MS (tripel kvadrupol) i vores tilfælde.
Inspireret af biologiske syntesefremgangsmåder af forbindelserne 1-4 blev udviklet ud fra 8-bromopurine derivater under eller fotolyse. 7,12 Disse procedurer involverer en radikal kaskadereaktion der efterligner DNA beskadigelse mekanisme for dannelse af 5 ',8-cdAdo og 5' ,8-cdGuo læsioner. Fra biologiske perspektiver, blev det konstateret, at disse læsioner ophobes med aldring i et væv-specifik måde (lever> nyre> hjerne), der beviser, at DNA reparation mekanismer er utilstrækkelige til at bevare det genetiske materiale fra disse læsioner. 13 Faktisk nukleotid excision reparation (NER) er den eneste vej nuværende tidspunkt identificeres til reparation af disse læsioner. 2
De to klassees af forbindelser vist i figur 1 og 5 ikke er kommercielt tilgængelige i øjeblikket, men de syntetiske strategier er beskrevet i litteraturen ville det ikke være vanskeligt at fremstille disse forbindelser til kommerciel brug.
Den tværfaglige tilgang, som kemiske biologiske undersøgelser ikke alene har en enorm værdi i identifikationen af nye mekanismer, der forekommer i det biologiske miljø, men giver også et afgørende bidrag til biomarkør opdagelse og diagnostik, i sidste ende bringe nyhed inden for sundhedspleje og forebyggelsesstrategier. 14 Den kemisk støtte er nødvendig for en vellykket udvikling af molekylær medicin, skabe integrerede platforme og paneler til metabolisk profilering, som forventes at give mulighed for en optimal rationalisering af interventionen design, enten terapeutisk og ernæringsmæssige, reducere usikkerhed og fiaskoer, når de kan være forudsigelig.
The authors have nothing to disclose.
Finansiel støtte fra Ministero dell'Istruzione, dell'Universita della Ricerca (prin-2009K3RH7N_002) og Marie Curie Intra-European Fellowship (CYCLOGUO-298.555) samt sponsorering af COST Action CM0603 om »frie radikaler i Chemical Biology og COST Action CM1201 om "biomimetiske Radical Chemistry" er modtaget med tak.
MATERIALS | |||
Cholesteryl linoleate ≥98% | Sigma-Aldrich | C0289-100 mg | |
Cholesteryl arachidonate≥95% | Sigma-Aldrich | C8753-25mg | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100 ml | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | |
Methanol 215 SpS | Romil | H409-2,5 L | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
Chloroform SpS | Romil | H135 2,5 L | |
n-Hexane 95% SpS | Romil | H389 2,5 L | |
Acetonitrile 230 SpS | Romil | H047 2,5 L | |
Dichloromethane SpS | Romil | H2022,5 L | |
Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 107344-1L | |
Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966-1L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
NaOH solid | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
NH4OH sol. 28%-30% | Sigma-Aldrich | 221228-1L-A | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | |
Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride | Sigma-Aldrich | 221759-100G | |
Ammonium Molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302-100G | |
Sulfuric Acid 95%-98% | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | 209139-25G | |
Sodium sulfate anhydrous | Sigma-Aldrich | 238597-500G | |
Nuclease P-I from penicillium citrinum | Sigma-Aldrich | N8630-1VL | |
Phosphodiesterase II type I-sa | Sigma-Aldrich | P9041-10UN | |
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc | Sigma-Aldrich | E114-25MG | |
Phosphatase alkaline type VII-t from*bov | Sigma-Aldrich | P6774-1KU | |
Phosphodiesterase I type VI | Sigma-Aldrich | P3134-100MG | |
Deoxyribonuclease II type IV from*porcin | Sigma-Aldrich | D4138-20KU | |
Trizma(r) base, biotechnology performanc ce | Sigma-Aldrich | T6066-100G | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644-100G | |
Succinic acid bioxtra | Sigma-Aldrich | S3674-250G | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670-100G | |
Formic acid, 98 % | Sigma-Aldrich | 06440-100ML | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Millipore | UFC500324 | |
8-Bromo-2′-deoxyguanosine | Berry & Associates | PR3290-1 g | |
8-Bromo-2′-deoxyadenosine | Berry & Associates | PR3300-1 g | |
Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
2′-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3899-CA-0.1 | |
2′-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3895-0.1 | |
Nitrous oxide (N2O) | Air Liquide | ||
Deoxyribonucleic acid from calf thymus | Sigma Aldrich | D4522-5MG | |
EQUIPMENT | |||
60Co-Gammacell | AECL- Canada | 220 | |
Immersion well reaction medium pressure 125 watts | Photochemical reactors ltd | Model 3010 | |
Evaporating flask 250 ml | Heidolph | P/N NS 29/32 514-72000-00 | |
Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm | Phenomenex | 00A-4252-E0 | |
Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm | Grace | 88081 | Semipreparative |
SecurityGuard Kit | Phenomenex | KJ0-4282 | Analytical holder kit and accessories |
Holder for 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7220 | Semipreparative holder |
10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7221 | |
High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1100 | |
LC/MS/MS | Applied Biosystems | 4000QTRAP System | |
Tandem mass ESI spectrometer | (Bruker Daltonics) | Esquire 3000 plus | |
Vial 2-4 ml | SUPELCO | Cod 27516 | |
Vial 4 ml | SUPELCO | Cod 27517 |