רדיקלים חופשיים בביולוגיה כימית: מהתנהגות כימית לפיתוח סמנים ביולוגיים

1. סינתזה של איזומרים מונה טרנס של אסטרים cholesteryl ממס אסטרים cholesteryl (linoleate או arachidonate cholesteryl אסתר) ב2-propanol (15 מ"מ). לsolubilization טוב יותר, דגימות sonicated במשך 15 דקות תחת ארגון. להעביר את הפתרון לכור פוטו קוורץ, להוסיף 2-2-mercaptoethanol בpropanol (כדי להגיע לריכוז mM 7, מפתרון מנייה 2 מ 'של thiol). לשטוף את תערובת התגובה עם ארגון במשך 20 דקות כדי לחסל את נוכחותו של חמצן בפתרון. להקרין תערובת התגובה על ידי אור UV באמצעות מנורת כספית בלחץ נמוך 5.5W ב22 ± 2 מעלות צלזיוס במשך 4 דקות. צג על ידי אנליטית Ag-TLC (כרומטוגרפיה שכבת כסף דקה) לראיות ההיווצרות של אסטרים cholesteryl מונה טרנס (ראה איור 1 לנוסחות הכימיות). מכתים TLC מתבצע על ידי שפיכת הצלחת באמוניום פתרון cerium molibdate (רמ"א), והכתמים מופיעים על חימוםהצלחת. להרוות את התגובה בשלב מוקדם, על מנת לשחזר את החומר המוצא, שניתן לעשות שימוש חוזרים לבצע סיבובים אחרים של isomerization, השיגו גידול של התשואה הכוללת. אסוף את תערובת התגובה בבקבוק עגול בתחתית, שוטף את המנגנון עם כמה מ"ל של 2-propanol. הסר ממס ולטהר את איזומרים מונה טרנס של אסטרים cholesteryl ידי Ag-TLC כפי שתוארו בספרות. 5 שימוש אתר הקסאן-diethyl (09:01 v / v) eluent למונה טרנס cholesteryl linoleate איזומרים, ואילו שימוש בקסאן -Diethyl חומצה אצטית-אתר (9:1:0,1 V / V) לאיזומרים arachidonate cholesteryl מונה טרנס. 2. בידודו של בר אסטרים cholesteryl מסרום אדם למהול 1 מ"ל של נסיוב אדם (מתקבל על ידי צנטריפוגה דם) עם 1 מ"ל של מי מלח ויוצק את התמיסה לתוך משפך separatory תחת זרם של ארגון על מנת להימנע מחפצים (למשל adducts חמצון). הוסף 10 מיליליטר כלורופורם מתנול (2: V 1 / V) שלוש פעמים. נער את משפך separatory לאט מאוד, במטרה לצמצם את ההיווצרות של אמולסיה בשל הנוכחות של אלבומין. שטוף את השכבות האורגניות פעם אחת עם מי מלח (10 מ"ל), ואז לאסוף בבקבוק Erlenmeyer תחת זרימת ארגון, יבש מעל גופרת נתרן נטולת מים. הסר נדיפים ידי מאייד סיבובי כדי להרשות לעצמו שמן צהוב (סך שבריר שומני פלזמה). קח את הגולמי עם 1 מ"ל של כלורופורם מתנול (2:1 v / v), עומס על preparative TLC תחת זרם של ארגון ולהשתמש בתערובת של אתר הקסאן-diethyl (09:01 v / v) eluent . לגרד את החלק המכיל סיליקה שבריר אסתר cholesteryl ולשפוך לתוך בקבוקון. ואז, לחלץ סיליקה (3 × 5 מ"ל) עם כלורופורם מתנול (2:1 v / v), לאסוף את השכבות האורגניות ולהסיר ממס לאחר האידוי להרשות לעצמו את החלק היחסי הטהור של אסטרים cholesteryl (~ 1.5 מ"ג בדרך כלל). שמור אסטרים cholesteryl בבקבוקון כהה המכוסים ברדיד אלומיניום מתחת לארגון ולאחסן ב -20 ° C. Cholesteryl דוארsters רגיש לאור ולחמצן. 3. אפיון של אסטרים cholesteryl מונה על ידי טרנס ראמאן ספקטרוסקופיה חלץ אסטרים cholesteryl מסרום אדם (≥ 0.7 מ"ג) כמפורט בסעיף 2, מתמוסס בכמות קטנה של פחמן טטרא (≤ 10 μl) ומקום בבקבוקון. CCl 4 נבחר כממס משום אות ראמאן אינה חופפת עם האזור של עניין של ניתוח אסתר cholesteryl. להעביר את הפתרון לבעל המדגם באמצעות כוס טפטפה פנויה, ואז להסיר ממס בקפידה על ידי זרם איטי של ארגון. ברגע שסרט שמנוני אחיד נוצר על הקיר הפנימי של בעל המדגם, הנח את האחרונים למכשיר למדידה. פורה שינה ספקטרום ראמאן של אסטרים cholesteryl מתקבל ישירות על תמציות שומנים ללא תגובת derivatization. כוח הליזר על המדגם הוא <100 mW, כדי למנוע ניזק לדוגמה. המספר הכולל של סריקותעבור כל קשת הוא ≥ 800 כדי למזער את רעשי רקע. מגוון -1 הסנטימטר 1,700-1,630 של ספקטרום ראמאן מנותח שכן הוא משקף את תרומתו של C = C אג"ח הנוכחי במולקולה (C = C מצב מתיחה) הכפול. ניתוח מתאים עקום מתבצע על אזור זה, ובכך מאפשר לייחד את התרומה גבי מציס וטראנס קשרים כפולים בשרשרת אלקיל השומנית וקשר כפול בטבעת B של כולסטרול (ראה איור 2). כדי להתאים כראוי את להקות רטט, כמה פרמטרים צריכים להיות קבועים או מוגבל בגבולות סבירים. פרופילי שיא המרכיבים מתוארים כקומבינציה ליניארית של פונקציות גאוסיים הלורנצי ו, בעוד שרוחב הפס בחץ הגובה נקבעים על ידי מיטב שגרת אופטימיזציה המחשב. המספר והמיקום של פסגות הרכיבים מתקבלים על ידי שימוש בספקטרום הנגזר הרביעי, שיאפשר לזהות כמה להקות רכיב חלשות גם. מאז האותיחס רעש שמתדרדר על התמיינות של האות יכול למנוע את השימוש בנגזרת הרביעית, החליק נגזרי 4 עם פונקציה 13 נקודתי סביצקי-Golay, הוא יתרון, ולכן פשרה נכונה בין רזולוציה ויחס אות לרעש מתקבלת . הולם עקומה הטוב ביותר מתקבלים ב2 ערכי c הנמוכים ביותר האפשריים. הנוכחות של טרנס איזומרים מתגלה על ידי הרכיב ב1671 ± 1 -1 סנטימטר, בנוסף, לפחות, שני המרכיבים, זז מעט לכיוון תדרים נמוכים, בשל שרשרת חומצת השומן וכולסטרול C = C קשרים כפולים. ספקטרום ראמאן נציג הפלזמה cholesteryl אסתר מוצג באיור 9. בהבלעת ההשוואה של אזור מסוים עם cholesteryl linoleate ומונה טרנס חומצה לינולאית איזומרים cholesteryl מוצגת. 4. Derivatization לאסטרים של חומצות שומן מתיל (FAME) וניתוח על ידי גז כרומטוגרפיה להמסאסטרים cholesteryl (~ 1.5 מ"ג) עם 0.5 מ"ל של פתרון 1 ז של נתרן הידרוקסידי בבנזן-מתנול (02:03 v / v) ומקום בבקבוקון כהה המכוסים ברדיד אלומיניום מתחת לארגון. השאר את התערובת תוך ערבוב בטמפרטורת חדר וצג על ידי TLC באמצעות תערובת של אתר הקסאן-diethyl (09:01 v / v) eluent. זמן תגובה הוא בדרך כלל 30 דקות, אבל ניטור תגובה זהירה נדרש. למעשה, ברגע אסטרים התיל המקבילים נוצרים, התגובה חייבת להיות quenched כדי למנוע ההיווצרות של מוצרים פגומים וצד. TLC הראה היווצרות כמותית של אסטרים מתיל. להרוות את תערובת התגובה על ידי הוספת 1 מ"ל של מי מלח ולחלץ מתיל אסטרים עם n-הקסאן (3 × 2 מ"ל). לאסוף את השכבות האורגניות לתוך בקבוקון ולהסיר ממס על ידי אידוי סיבובי כדי להרשות שבריר מתיל אסטר, אשר לאחר מכן משמש לניתוח GC ללא טיהור נוספת. ממס את אסטרים מהתיל בכמות המינימאלית של n-הקסאן (בדרך כלל 1 מ"ג ב 50 μl) ולהזריק בGC מצויד ב60 מ '× 0.25 מ"מ × 0.25 מיקרומטר (50% cyanopropyl)-methylpolysiloxane עמודות. השתמש בגלאי יינון להבה (FID) עם תכנית התנור הבאה: התחלה בטמפרטורת 165 מעלות צלזיוס, להחזיק 3 דקות, ואחרי העלייה של 1 ° C / דקות עד 195 מעלות צלזיוס, להחזיק 40 דקות, ואחרי 2 גידול של 10 מעלות צלזיוס / דקות עד 240 מעלות צלזיוס, ולהחזיק למשך 10 דקות. מצב לחץ מתמיד (29 psi) נבחר. ניתן להשתמש בהליום או מימן כגז המוביל. אסטרים תיל מזוהים על ידי השוואה עם זמן השמירה של דגימות אותנטיות. איור 10 מציג ניתוח GC נציג FAME מתקבל מאסטרים פלזמת cholesteryl. 5. סינתזה של (5'R) – ו (5'S) -5 ',8-סקל-2'-deoxyadenosine להמס 33 מ"ג של 8-2'-deoxyadenosine bromo (8-BR-דדה) באצטוניטריל (100 מ"ל) כדי להגיע לריכוז 1 מ"מ. לווסת את זרימת גז (Ar או N2) בphotoreactor ולמלא את אפהratus עם הפתרון של 8-BR-דדה. הכן את המחיצה עם הגודל המתאים לקלט של photoreactor ולהעביר מחט מחוברת לקו גז אינרטי דרך המרכז שלו. סגור את המערכה עם המחיצה. לשטוף גז אינרטי למשך 30 דקות. להקרין על ידי אור UV באמצעות מנורת כספית 125W בינוני לחץ בגיל 22 ± 2 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, לאסוף את הפתרון לבקבוק 250 מ"ל עגול תחתי. שטוף photoreactor עם אצטוניטריל מ"ל 10 ולאסוף כביסות באותו הבקבוק. להרוות את תגובת התערובת הגסה עם 4 פתרון 1 ז NH OH ולהתאדות הממס במאייד הסיבובי. הפעל ניתוח ביצועים גבוה נוזלי הכרומטוגרפיה (HPLC-UV) עם עמודת אנליטי (ראה סעיף מכשור) בתנאים ידועים, ולהשוות את הפרופיל עם תרכובות התייחסות. הפעל ניתוח ביצועים גבוה נוזלי הכרומטוגרפיה (HPLC-UV) עם עמודת אנליטי (ראה סעיף מכשור) באמצעות הסול הבאפתחים ומעברים: 2 formate אמוניום mM כממס וממס אצטוניטריל כמו ב 'הגדר את קצב הזרימה ל1 מ"ל / דקה והשיפוע B ממס 0% עד 0.3% ב ממס שהגיע ב2.2 דקות. אז 0.8% ב ממס ב4.0 דקות אז B, 1% ממס ב4.8 דקות. תישאר בB ממס 1% ל 9 דקות ואז ללכת ל-B ממס 8% ב6 דקות. לאחר ללכת ל-B ממס של 10% ב4 דקות ול-B ממס של 30% ב5 דקות ולהישאר בב 30% ממס למשך 5 דקות אחרות. אסוף את השיאים המתאימים לשני מוצרי diastereomeric בשני בקבוקונים שונים chromatographic. מדוד את הספיגה של שני שברים שנאספו בספקטרופוטומטר UV ולחשב את הריכוז המדויק המבוסס על חוק Lamber באר (= εlC, שבו היא ספיגת ε מקדם ההכחדה ואני אורך של התא). השתמש ε מקדמים ההכחדה של 2'-deoxyadenosine (דדה) (15,400 -1 סנטימטר M -1 ב260 ננומטר). 6. סינתזה של (5'R) -ד (5'S) -5 ',8-סקל-2'-deoxyguanosine להמס 35 מ"ג-2'-deoxyguanosine 8 bromo (8-BR-dGuo) ו 30 מ"ג של יודיד הנתרן (Nai) במים מזוקקים (100 מ"ל) כדי להגיע לריכוז 1mm ו2 מ"מ, בהתאמה. לווסת את זרימת הגז אינרטי (Ar או N 2) מחוברת לphotoreactor ולמלא photoreactor עם פתרון התגובה. Degass תערובת התגובה, כמתואר בהליך 5 (שלב ב). להקרין על ידי אור UV באמצעות מנורת כספית 125W בינוני לחץ בגיל 22 ± 2 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, לאסוף את הפתרון לבקבוק 250 מ"ל עגול תחתי. שטוף photoreactor עם 10 מ"ל של מים ולאסוף כביסות באותו הבקבוק. להרוות את תגובת התערובת הגסה עם 4 פתרון 1 ז NH OH ולהתאדות הממס תחת ואקום. ביצוע ניתוח כמתואר בנוהל 5 (שלבי ה 'לז). השתמש ε מקדמים ההכחדה של 2'-deoxyguanosine (dGuo) (11,700 -1 סנטימטר M -1 ב260 ננומטר). 7. סינתזה של purine תווית איזוטופי (5'R) – ו (5'S) -5 ',8-cyclonucleosides הכן 2 מ"ל של תמיסה מימית 1mm (מים מזוקקים) מתוך 15 N האיזוטופי נוקלאוזידים purine הכותרת ([15N 5] או דדה [15N 5] dGuo) בבקבוקון זכוכית (4 מ"ל) עם כובע מחץ. חבר את הבקבוקון עם מכסה המחיצה ולהתחבר לצינור הגז (N 2 O לרוויה של הפתרון) באמצעות מחט במחיצה המגיעה לתחתית המכל. מחט קצרה נוספת בכובע מחץ עובדת כיציאת גז. שטוף את הפתרון עם N 2 O למשך 30 דקות. זרימת הגז מוסדרת להיות נמוכים מאוד. מחט היציאה נלקחת ראשונה יצאה ואחרי 1 'אחד הארוך בא, על מנת שיהיה לחץ קטן בתוך הבקבוקון. שים את הפתרון במנגנון של radiolysis גמא ל8 (חישוב על בסיס מינון שיעור CA. 4.5 Gy / דקה) שעות. לאחר תגובה להרוות הגולמית עם M NH 1 4 </sUB> OH פתרון. הפעל ניתוח ביצועים גבוה נוזלי הכרומטוגרפיה (HPLC-UV) בתנאים ידועים, 6 והשווה הכרומתוגרמה עם הפניות הסטנדרטיות. 8. Radiolysis גמא פתרוני DNA מימיים הכן 1 מ"ל של פתרון מ"ל (מים מזוקקים) של ה-DNA התימוס העגל 0.5 מ"ג / ולשים בבקבוקון זכוכית (2 מ"ל) עם כובע מחץ. Degass התגובה, כמתואר בנוהל 7 (צעדי BD). שים את הפתרון במנגנון של radiolysis גמא למשך 30 דקות (חישוב על הבסיס של מינון / שיעור CA. 4.5 Gy / דקה). 9. עיכול אנזימתי של ה-DNA לצינור המכיל 80 מיקרוגרם אפנדורף של ה-DNA, להוסיף 8 U של nuclease P1, 0.01 U של phosphodiesterase השני, 20 ננומול של EHNA ב20 μl יצטט 300 מ"מ נתרן (pH 5.6) וכלוריד אבץ 10 מ"מימ. דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. הבא להוסיף תערובת של U 8 של phosphatase אלקליין, 0.02 U של phosphodiesterasדוארי, בגיל 40 μl של 0.5 מ 'טריס-HCl חיץ (pH 8.9) לעיכול תערובת. מדגם הודגרו ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. התערובת מנוטרלת על ידי תוספת של חומצה פורמית 10%. להעביר את הדגימה למכשיר Amicon Ultra-0.5 צנטריפוגלי מסנן (3 kDa הגזור), להוסיף 200 μl של tridistilled H 2 O. הנח את Ultra-מסנן לתוך הרוטור בצנטריפוגה XG 14000 במשך 15 דקות. ואז להפריד את מכשיר מסנן אולטרה מצינור microcentrifuge. Lyophilize פתרון אנזימים החופשיים בצינור microcentrifuge. 10. התפלת דגימת DNA לפני הניתוח הפעל ניתוח ביצועים גבוה נוזלי הכרומטוגרפיה (HPLC-UV) עם עמודת אנליטי (ראה סעיף מכשור) בעקבות תנאים ידועים. 6 ממס את ה-DNA מתעכל lyophilized ב20 μl של H 2 O ולהזריק בHPLC-UV. איסוף הדגימה בבקבוקון לאחר elution המלח (דקות ראשונות) וממש לפני elution timדואר של nucleoside הראשון (5'R-cdGuo), עד לסיום תכנית הכרומטוגרפיה. מדגם lyophilized וresolubilized במי μl 20. 11. ניתוח כמותי LC-MS/MS הכן את HPLC-MS/MS (quadrupole המשולש) לפני שמתחיל את הניתוח על ידי טעינת השיטה אנליטית והשיטה לגלאי MS (ESI). 6 הוסף μl 1 מתוך תערובת תרכובות המסומנות האיזוטופי במדגם שהוכן בנוהל 7. הזרק 20 μl של פתרון ה-DNA הממוסמר מתעכל במים מזוקקים. הנתונים המתקבלים chromatographic מעובד על בסיס כיול הקודם עם תרכובות התייחסות. נציג HPLC להפעיל מכיל אדנוזין וguanosine 2'-deoxyribonucleosides והחמצון שלהם והנגזרים סקלו מוצג באיור 11.