在体内病态的人类基因组建模使用斑马鱼

隐性和Pseudorecessive失调初级纤毛近乎无处不在的结构在脊椎动物体内计划，发挥细胞信号传导的角色，在多种细胞的命运，包括增殖，极性，分化和组织维护这些细胞器的功能障碍导致了广泛的人类遗传性疾病统称为称为ciliopathies 6,7这样一个临床实体Bardet Biedl综合征（BBS），多系统的儿科疾病，视网膜变性，肥胖，性腺功能低下，多指（趾），肾功能不全特征。 在体内检测致病等位基因的发展是必要的论坛因为）它是一种遗传异质性疾病引起的主要是私人的同义变化发生在至少17个基因7-10;和b）寡继承> BBS家庭的25％，其中杂合子的变化在第二论坛除了隐性主要的致病突变基因（）可以调节临床外显率和表现。通常情况下，这样的第三等位基因杂合子的同义变化，从遗传学的角度来看，还不清楚致病潜力，因此需要准确的解释，他们对蛋白质功能的生物效应。11-13 探讨潜在的致病突变论坛突变负荷做出贡献，我们初步确定BBS1 – BBS14测试了所有的错义变化。我们和其他人已经表明，基体蛋白损失产生失调的平面细胞极性（PCP非经典Wnt信号）表现为收敛扩展的缺陷，在斑马鱼胚胎中体节14使用此有关生理表型读出，已经发现，抑制BBS基因体轴缩短，更广泛和更薄的体节，而宽，扭结notochords的15 </线上（图2）引起的MO抑制产生的原肠胚形成的缺陷，和共注射与人类mRNA的显着获救（再现性）这些表型的得分由三种不同的体内方法。首先，胚胎被现场拿下根据定性的表型标准（正常，I类和II类的表型类的详细定义见15）。接下来，我们在外包过程中定量细胞迁移（早期发育阶段的特点是在卵黄细胞16）通过采用荧光示踪可视化迁移细胞的细胞层变薄和传播。最后，我们测量体节的躯干长度在9体节胚胎原位杂交的鸡尾酒krox20，PAX2和myoD的的的核糖探针，持平安装形态分析。 这种方法已经被用来测试500等位基因在睫状肌突变空间超出。在一个体内检测> 130等位基因独自学习，产生了一系列的表型的分数，我们的协议表示（图1）完成救援被列为良性（不显着不同的从WT救援），部分抢救被列为hypomorphs的（显着改善来自密苏里州，但更严重的比WT救援），故障救援功能空（没有显着不同MO）和表型诱导突变基因被列为主导底片相比，MO被列为。 我们也评估，灵敏度和特异性的斑马鱼体内互补实验。特异性证实了合作注入常见SNPs（> 5％的次要等位基因频率在健康对照人群），这些被发现给予良性的表型，在14/17测试（> 82％），和敏感性被证明是98％ 体内数据和遗传参数足以吨之间的一致性O属性等位基因作为在一个BBS血统因果。17此外，使用三个体内措施（外包跟踪，现场打分，ISH形态测量） 在体外用免疫印迹和细胞定位研究验证观察到的表型效应。虽然解释这些结果前需要了解至少一种疾病的发病机制，这个例子中提供的证据，以证明我们的协议的实用性和鲁棒性。以来，我们已经证实了我们的在体内得分与多个其他线路在一个公正的突变筛查和功能实验证据分析研究TTC21B的 ，逆行intraflagellar的转运蛋白。 主导疾病肢带型肌营养不良症（LGMD）类肌营养不良症是一种常染色体显性遗传，造成缓慢前进中在臀部和肩膀的肌肉无力。我和这个基因chanistically组异质性疾病所造成的显性和隐性突变跨越多个细胞膜，肌节，细胞质和细胞核蛋白。基于磁共振成像肌受累的临床表型和证据的呈现，我们调查的主导的原因在芬兰，美国和意大利的家庭19 LGMD发现。在映射的轨迹位置的候选人测序揭示突变在DNAJB6，至少两个剪接异构体（细胞核和细胞质）在人类基因编码的共同分子伴侣HSP70家族表示。要获得DNAJB6功能和其相关LGMD的进一步深入了解，我们在斑马鱼研究其作用在肌肉的完整性。的斑马鱼（dnajb6b）直向同源物的RT-PCR方法检测到表达为早五体节阶段，然后通过注射的胚胎与拼接阻塞的吗啉代。在受精后48小时，蒙面的得分表明支队慢纤维插入点。这种表型的特异性进行测试的第二非重叠MO，并随后与野生型人类DNAJB6 mRNA的救出。 要查询如何损失DNAJB6功能导致肌肉的完整性的缺陷，我们介绍了发现的错义突变的患者为人类转录两种异构体，并将其注射到斑马鱼的胚胎。虽然注射WT人类mRNA的产生没有明显的表型，这些变化phenocopied工程时，在细胞质中的MO的作用效果的损失，但不是核的异构体。其次是共注射等摩尔量的突变体和野生型的mRNA，这表明增强肌肉表型的严重程度，提出了显性效应。为了测试这个概念，改变突变体和野生型基因的摩尔比进行了进一步的注射。与预测相一致，较WT诱导胚胎致死突变的mRNA的过量，而Ñ​​过量生产的WT逐步增加救援。在这之后， 在体外实验中，确定oligimerization性能和可能的蛋白质的相互作用。这些表明，突变损害细胞质DNAJB6的抗凝集活性和干扰的突变型和野生营业额，以及与另一个的分子，BAG3，这也是相关的病理机制的LGMD，由于LOF BAG3导致的儿科形式肌营养不良症20。我们然后问是否BAG3可以调节表型诱导斑马鱼突变DNAJB6b的的。 ，虽然注射WT BAG3独自制作没有表型，共注射与DNAJB6突变体显着增加的表型的严重程度，这是BAG3这些突变体19介导的致病性中起重要作用。 瞬态斑马鱼模型 <TD> 突变斑马鱼线 转基因小鼠线 人类表型的发病年龄正在调查 产前新生儿小儿科的产前新生儿小儿科的产前新生儿小儿科的成人 可行的表型 颅面肌肉发达发信号心脏的肾血管颅面肌肉发达发信号心脏的肾血管颅面肌肉发达发信号心脏的肾血管感觉的骨骼内脏行为呼吸生殖内分泌代谢 直到使用时间 （从出生） 1-7天 > 3个月 > 6个月 吞吐量 中高低低 优点 测试特定突变的能力能够产生连锁反应的型号能够使用吗啉击倒低维护成本减的实验变异关于建立更紧密进化关系器官结构的保护基因的能力率敲在模型 表1中。 体内模型中的比较 。 表2中。下测试所提出的协议的实施例中体内人类dysmorphologies建模。各种表型。可采用一系列的表型的读数和可视化技术的基于无序的类型。 点击这里查看更大的表。 如图1所示。 在体内功能测试同义变种。所有功能测试系统的方法ELES模型未知或假设的意义。其次是由一系列的（共）注射野生型和突变型人mRNA的基因敲除通过吗啉代显微注射。统计分析表型的结果告知等位基因致病性和分子功能。简言之， 丧失功能测试：如果击倒产生突变体和野生型表达的表型可以等价获救的等位基因可能是良性的（绿盒）。如果击倒表型突变救援击倒表型没有区别，等位基因可能是一个功能性空（黄色框）。如果拦截表型的突变拯救比MO的显着水平，但比野生差，等位基因可能是一个hypomorph（绿色方块）。 对于显性的测试：如果突变的mRNA注射相当于野生型的mRNA的等位基因可能是良性或丧失功能，或可能已经失败的实验（绿盒）。如果突变的mRNA注射因迪斯区别开从MO拦截，基因产物的功能，有可能以某种方式改变。为了区分在功能上的变化，滴定突变体与野生型的mRNA的mRNA。如果该滴定的结果是无法区分野生型的mRNA的单独突变蛋白产品使用的野生型蛋白作为底物，从而指示一个显性阴性表型（蓝色框）。如果滴定的结果是无法区分的单突变的mRNA，突变蛋白质产物不再具有与野生型的功能相同，因此，很可能的增益函数（蓝色框）。如果没有表型呈现从MO拦截，但不与野生型的mRNA的存在，可能会出现进一步的实验，WT人类mRNA的滴定，以尽量减少表型，也可以用来作为一个新的设定点。野生型和突变型人mRNA的进一步的共注射可以评价根据抢救能力的突变体（粉红色框）。ET =“_blank”>点击这里查看大图。 图2。定量和定性的评价MKS1突变检测在人类中MKS1 morphant的胚胎发育缺陷。根据严重性分为三组，表型。每个类的实例所示（a）中 ，普遍存在于胚胎世代组（n = 100-160胚胎）的表列（图中未示出）。 MO注射胚胎I类表型正常形态，但有严重较短，蛋黄相比过多的胚胎组织来控制注射的胚胎在相同的体节年龄（8-9体节）。被II类与colo2a1的变薄，短而不发达的头部和尾部结构，另外缺乏体节的定义和对称性。 III类胚胎体节发育不良和畸形的严重延误，起伏notochords，通常没有生存过去的10体节阶段。共注射的人类MKS1 mRNA的救出这些缺陷，MKS1抑制证明特异性表型。胚胎在11体节阶段（±1体节）染色，krox20，PAX2和myoD的核糖探针原位杂交（乙，丙）。表型进行定量测量从第一个到最后一个明显的体节的每个胚胎（箭头）， 在 c定量。图改编许可15。 图3。人类畸形学的体内模型中的例子。 （一）颅面畸形学。控制基因注射胚胎（左）和突变体注射胚胎（右）在5 DPF阿尔辛蓝染色。突变的mRNA注入胚胎显示特别是小，畸形头张开鳃弓和缺失或异常结构包括颅面骨软骨与一般的混乱。（二）微/大头畸形。控制未注射胚胎（左）和kctd13 MO注射胚胎（右）在5 DPF。与colo2a1显示加宽的头部，所看到的眼睛之间的空间21（c）减少血管的完整性。控制未注射胚胎（顶部）和2 DPF在FLI1用荧光显微镜成像英 MO注射胚胎（底部）：绿色荧光蛋白转基因记者线。与colo2a1显示减值发芽间血管和其他血管结构。41（D）单向原位杂交心脏循环改变。野生型胚胎njected（左）显示SPAW表达在左外侧板中胚层，而ccdc39 morphant胚胎表现为双侧（右），在大多数情况下，检测不到的SPAW表达（未显示），43（E）肾囊肿。未注射WT胚胎（顶部）和ift80 morphant的（底部）。的显示与colo2a1大的肾囊肿（箭头），心包水肿（箭头）和卷曲的尾巴。44（F）肾小球滤过减少。荧光可视化控制注射胚胎（顶部）和罗丹明右旋糖酐注射到心脏后ift80 morphant的（底部）24小时。荧光分散在整个血管系统和几乎完全抽空肾脏观察荧光，完全没有控制。 morphant的显示持久的荧光右旋糖酐，提示肾小球滤过减少46（克）肌肉萎缩症。 WT DNAJB6先生NA注射胚胎（顶部）显示正常的慢肌纤维跨越体节通常相邻myosepta之间的如使用防慢肌球蛋白抗体免疫组化确定。突变DNAJBb（底部）显示在一个或多个个体节，局部完成支队从myosepta肌纤维，19（H）体节角。放大控制注射的（顶部）或底部）kif7的与colo2a1（30高倍视野成像的现场侧面的景致。的显示与colo2a1异常形状的体节，占异位刺猬信号在斑马鱼的肌节47 经许可后改编的所有数字。