脑脊液分离解剖大脑皮质外植体使用的啮齿动物胚胎
Summary
心室脑脊液（CSF）沐浴在早期的大脑发育在胚胎神经上皮和大脑皮质祖细胞。在这里，我们描述的方法，从不同年龄层的啮齿动物胚胎隔离室CSF，为了研究其生物学功能。此外，我们展示了我们的脑皮质外植体的解剖和文化的技术，可以为外植体生长的培养基或CSF以最小的体积。
Abstract
CSF是一种复杂的流体动态变化的蛋白质组的整个开发过程，并在成年后。在胚胎发育过程中，新生的CSF区别于前神经管闭合时的羊水。 CSF卷，然后在随后的日子里，排队的神经上皮干细胞的心室和脉络膜丛产生CSF增加。胚胎CSF接触的顶端，心室发育中的大脑和脊髓神经干细胞的表面。 CSF提供了重要的流体压力发育中的大脑的扩展和分发重要的增长推动因素，神经祖细胞在时间上的具体方式。要调查的CSF的功能，重要的是不从血液或显影端脑组织污染隔离胚胎脑脊液的纯样品。在这里，我们描述了一种技术，以隔离的心室胚胎CSF可用于相对纯的样品质谱，蛋白质电泳，和细胞与初级外植体培养的实验分析，包括范围广泛的。我们演示了如何剖析和文化多孔聚碳酸酯膜的皮层外植体对以成长发展的皮层组织与媒体或CSF的量的减少。使用这种方法，可以进行实验，使用CSF从不同年龄或条件调查对靶细胞的CSF蛋白质组的生物活性。
Introduction
CSF是一种复杂的流体，沐浴神经上皮1-6，并提供必要的压力7和促进生长发育中的大脑8-12线索。研究CSF在大脑发育过程中，我们开发的技术隔离室CSF来自发展中国家的大鼠或小鼠胚胎过程中各阶段的发展6,9。往前的隔离的方法包括用玻璃微针和隔离的CSF使用微喷射器1,2。我们的方法利用玻璃微毛细吸管的尖端一直拉到创建一个超细点，以提高组织的渗透。玻璃微毛细吸管被连接到一个吸气器与温和的压力变化，使心室CSF可以控制收集。为了研究干细胞的的CSF信号的影响，我们解剖大脑皮质外植体，将它们放置在聚碳酸酯膜，并把它们飘浮在适当的铜CSF样品9 lture培养基中。利用这种技术，减少体积的介质来培养的组织，是足够允许脑脊液9的有效利用。
Protocol
Representative Results
Discussion
心室CSF收集所描述的方法，已经取得了相当纯的胚胎脑脊液样品与在一些细胞分析9的稳定的蛋白质组合物，和一致的活性。有了一个良好的采集技术和产仔数的10 E14.5小鼠，可以预期的CSF收集10-15微升，并从E16鼠一窝，谁也无法预料的CSF收集约50-90微升。此收集技术，从血液和组织中的污染最小化，通过仔细观察，离心分离，和废弃的样品与细胞碎片或血色调的任何证据。我们已经分析了?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们是从美国国立卫生研究院（奖励R00 NS072192 MKL，HD029178到AS.L.，2 RO1 NS032457到CAW）的支持表示感谢。 MKL是波士顿儿童医院的职业发展奖学金/哈佛医学院岸奖学金和研究员Alfred P. Sloan基金会的收件人。 CAW是霍华德·休斯医学研究所的研究员。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Wiretrop II capillary needles | Drummond Scientific | #5-000-2020 | |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | #184 SIL ELAST kit | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | #A5177-5EA | |
| Disposable filter | Venturi or local pharmacy | not available | Standard cigarette filter |
| Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife) | World Precision Instruments, Inc. | #500250 | |
| 35mm glass bottomed culture dish | MatTek Corp. | #P35G-1.5-14-C | |
| Platinum-iridium wire | Tritech Research | #PT-9010-010-3FT | |
| Nuclepore Track-Etch Membrane | Whatman | #09-300-57 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | #SH30031.FS | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | #15000-02 |
Referências
- Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development. Biologia do Desenvolvimento. 83 (1), 193-200 (1981).
- Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).
- Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).
- Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid. Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).
- Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).
- Desmond, M. E., Jacobson, A. G. Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure. Biologia do Desenvolvimento. 57 (1), 188-198 (1977).
- Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).
- Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).
- Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).
- Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Biologia do Desenvolvimento. 297 (2), 402-416 (2006).
- Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).
