मानव pluripotent स्टेम सेल से Telencephalic glutamatergic न्यूरॉन्स की विशिष्टता
Summary
इस प्रक्रिया चौकियों के माध्यम से जा रहा है जो मानव विकास के दौरान मनाया उन लोगों के लिए समान हैं द्वारा telencephalic न्यूरॉन्स पैदावार. कोशिकाओं को अनायास अंतर करने के लिए अनुमति दी जाती है, कारक हैं जो उन्हें तंत्रिका वंश की ओर धक्का उजागर कर रहे हैं, अलग – थलग कर रहे हैं, कर रहे हैं और coverslips पर चढ़ाया टर्मिनल भेदभाव और परिपक्वता के लिए अनुमति देते हैं.
Abstract
यहाँ, कुशलतापूर्वक मानव pluripotent स्टेम सेल (पीएससी) से telencephalic glutamatergic न्यूरॉन्स पैदा करने के लिए एक stepwise प्रक्रिया में वर्णित किया गया है. भेदभाव प्रक्रिया clumps जो गोल करने के लिए समुच्चय फार्म जब कोशिकाओं को एक निलंबन संस्कृति में रखा जाता है में मानव PSCs तोड़ने द्वारा शुरू की है. समुच्चय फिर 1-4 दिनों से hESC माध्यम में वृद्धि करने के लिए सहज भेदभाव के लिए अनुमति देते हैं. इस समय के दौरान, कोशिकाओं तीन रोगाणु परतों के किसी भी हो क्षमता है. 5-8 दिनों से कोशिकाओं को एक तंत्रिका प्रेरण माध्यम में रखा जाता है उन्हें तंत्रिका वंश में धक्का. 8 दिन के आसपास, कोशिकाओं को 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर देते हैं और neuroepithelial कोशिकाओं फार्म के समय के दौरान जो अंतर करने के लिए अनुमति दी जाती है. इन neuroepithelial कोशिकाओं को 17 दिन में अलग किया जा सकता है. कोशिकाओं तो neurospheres के रूप में रखा जा सकता है जब तक वे coverslips पर चढ़ाया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं. किसी भी caudalizing कारकों के बिना एक बुनियादी माध्यम का प्रयोग, neuroepithelial कोशिकाओं specifieघ telencephalic व्यापारियों, जो पृष्ठीय telencephalic progenitors और glutamatergic न्यूरॉन्स में तो आगे किया जा सकता है कुशलतापूर्वक विभेदित में. कुल मिलाकर, हमारी प्रणाली शोधकर्ताओं के लिए मानव glutamatergic न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए इन न्यूरॉन्स के विकास के अध्ययन और रोग है जो उन्हें प्रभावित करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है.
Introduction
मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं (पीएससी) दोनों मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) सहित, शरीर में हर कोशिका प्रकार सहित न्यूरॉन्स 1-3, पैदा करने की क्षमता है. मानव PSCs से विभिन्न neuronal उपप्रकारों का निर्देशित भेदभाव पुनर्योजी चिकित्सा में इन कोशिकाओं के आवेदन के लिए कुंजी धारण. कार्यात्मक neuronal subtypes के विकास के दौरान पीढ़ी एक जटिल तंत्रिका वंश की प्रेरण, समास में प्रयुक्त रूप – दुम का अक्ष साथ क्षेत्रीय progenitors के विनिर्देश, और बाद mitotic क्षेत्रीय 4,5 progenitors से न्यूरॉन प्रकार के भेदभाव की प्रक्रिया में शामिल है. 2001 में शुरू, कई सिस्टम hESCs, जो neuronal 6,7 उपप्रकारों के बाद पीढ़ी के लिए एक मंच प्रदान किया है से तंत्रिका वंश को उत्पन्न करने के लिए स्थापित किया गया है. विकास के सिद्धांतों, रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स 8-12, मध्यमस्तिष्क DOP जैसे कई न्यूरॉन प्रकार के आधार परaminergic 13-15 न्यूरॉन्स, और तंत्रिका कोशिकाओं रेटिना 16,17 कुशलतापूर्वक मानव PSCs से निर्दिष्ट किया गया है. यह महत्वपूर्ण morphogens जो इन न्यूरॉन प्रकार के विनिर्देशन के लिए vivo विकास में के दौरान महत्वपूर्ण हैं लागू करने के द्वारा किया गया था. अन्य प्रोटोकॉल भी या तो छोटे अणुओं के रूप में या अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ सह संवर्धन द्वारा अतिरिक्त 18-20 कारकों का उपयोग करने के लिए मदद के लिए 21 भेदभाव को बढ़ावा देने के न्यूरॉन्स में hESCs के भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए विकसित किया गया है.
मानव neocortex अत्यधिक विकसित की है और glutamatergic न्यूरॉन्स जो सीखने, स्मृति और संज्ञानात्मक 22,23 समारोह में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सहित कई प्रकार की कोशिकाओं, शामिल हैं. संस्कृति में glutamatergic न्यूरॉन्स पैदा करने में पहला कदम लिए telencephalic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं निर्दिष्ट है. Yoshiki Sasai समूह पहले माउस ESCs (mESCs) से निर्देशन telencephalic व्यापारियों के भेदभाव एक सीरम मुक्त suspensio का उपयोग कर सूचना दीn DKK1 की उपस्थिति (जो WNT सिगनल रोकता है) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से LeftyA (जो नोडल संकेतन रोकता है) 24 में संस्कृति. बाद में, हमारा सहित कई समूहों को भी सीरम मुक्त मध्यम 25-27 में मानव PSCs से telencephalic व्यापारियों के विनिर्देशन की सूचना है. मानव PSCs से telencephalic व्यापारियों की पीढ़ी की आवश्यकता नहीं है exogenous morphogens और इन व्यापारियों को पैदा करने में दक्षता का उपयोग 26,27 mESCs से तुलना में बहुत अधिक है. यहाँ, तंत्रिका प्रेरण है जो अच्छी तरह से जांग 7 समूह द्वारा स्थापित किया गया था के लिए एक रासायनिक परिभाषित प्रणाली में वर्णित किया गया है. Exogenous caudalizing कारकों के अलावा बिना, इस प्रोटोकॉल कुशलतापूर्वक मानव 27 PSCs से telencephalic व्यापारियों उत्पन्न करता है. ये तो progenitors Wnt और ध्वनि हाथी (श) का संकेत विनियमन द्वारा पृष्ठीय या ventral progenitors में भेदभाव किया जा पृष्ठीय progenitors आगे glutamatergic न्यूरॉन्स ई में अंतर कर सकते हैं.fficiently 27. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल glutamatergic न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए मानव iPSCs 28, जो रोगी विशेष न्यूरॉन्स कि रोगों का एक बड़ा सरणी के लिए कार्रवाई के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संभावित उपचारों के तंत्र का पता लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है से भी अच्छी तरह से काम करता है . इसके अलावा, हमारी प्रणाली भी telencephalon में विविध neuronal प्रकार के विकास के विनिर्देशन का पता लगाने के लिए एक मंच प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
तंत्रिका भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि मानव PSCs pluripotent क्योंकि अन्यथा कोशिकाओं को पहले से ही एक गैर neuronal वंश बनने की ओर पक्षपाती किया जा सकता है….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के लिए उदारता FOXG1 एंटीबॉडी के के लिए डा. वाई Sasai शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम कनेक्टिकट स्टेम सेल रिसर्च (022 08-SCB-UCHC- और 11-SCB24) अनुदान और अंधव्यवस्थात्मक paraplegia फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Reagent | Supplier | Catalog # |
| Dulbecco’s modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Gibco | 11330-032 |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | 10828-028 |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 1140-050 |
| 2-Mercaptoethanol (14.3 M) | Sigma | M-7522 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| N2 | Gibco | 17502-048 |
| B27 | Gibco | 12587-010 |
| Heparin | Sigma | H3149 |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) | Sigma | 116K5103 |
| Laminin (human) | Sigma | L-6274 |
| Laminin (mouse) | Invitrogen | 23017-015 |
| FBS | Gemini | 100-106 |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 |
| Dispase | Gibco | 17105-041 |
| Collagenase | Invitrogen | 17104-019 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| ROCK Inhibitor | Stemgent | 04-0012 |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Invitrogen | 13256-029 |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075 |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B |
| Foxg1 antibody | Dr. Y. Sasai | |
| Hoxb4 antibody (1:50) | Developmental Studies Hybridoma Bank | I12 |
| Pax6 antibody (1:5000) | Developmental Studies Hybridoma Bank | PAX6 |
| Nkx2.1 antibody (1:200) | Chemicon | MAB5460 |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 |
| vGLUT1 antibody (1:100) | Synaptic Systems | 135302 |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | PrepoTech Inc. | 450-02 |
| Glial derived neurotrophic factor (GDNF) | PrepoTech Inc. | 450-10 |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | PrepoTech Inc. | 100-11 |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | D-0260 |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D | 1845-SH |
| 50 ml tubes | Becton Dickinson (BD) | 352098 |
| 15 ml tubes | BD | 352097 |
| 6 well plates | BD | 353046 |
| 24 well plates | BD | 353047 |
| T25 flasks (untreated) | BD | 353009 |
| T75 flasks (untreated) | BD | 353133 |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 |
| 6 cm Petri dishes | BD | 353004 |
| 9” glass pipetes | Fisher | 13-678-20D |
| Steriflip filters (0.22 μM) | Millipore | SCGP00525 |
| Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) | Millipore | SCGPU10RE |
| Phase contrast microscope (Observer A1) | Zeiss | R2625 |
| Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) | Thermo Electron Corporation | |
| Biosafety hood (Sterilgard III Advance) | The Baker Company | |
| Centrifuge (5702 R) | Eppendorf |
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