Summary

Inspelning elektrisk aktivitet från Identifierade nervceller i den intakta hjärnan av transgen fisk

Published: April 30, 2013
doi:

Summary

I den här videon, kommer vi att visa hur man registrerar elektriska aktiviteten från identifierade enskilda nervceller i hela hjärnan beredning, vilket bevarar komplexa neurala kretsar. Vi använder transgen fisk i vilken gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) nervceller är genetiskt märkta med en fluorescerande protein för identifiering i den intakta hjärnan beredning.

Abstract

Förstå cellens fysiologi nervbanor som reglerar komplexa beteenden har ökat avsevärt genom att använda modellsystem där detta arbete kan utföras i en intakt hjärna beredning där neurala kretsar i CNS förblir intakt. Vi använder transgen fisk i vilken gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) nervceller är genetiskt märkta med grönt fluorescerande protein för identifiering i den intakta hjärnan. Fisk har flera populationer av GnRH neurons, och deras funktioner är beroende av deras läge i hjärnan och den GnRH-genen att de uttrycker en. Vi har fokuserat vår demonstration på GnRH3 neuroner i terminalen nerver (TN) är förknippade med lukt glödlampor med den intakta hjärnan av transgen medaka fisk (Figur 1B och C). Studier tyder på att medaka TN-GnRH3 nervceller är neuromodulatory, i egenskap av en sändare av information från den yttre omgivningen till det centrala nervsystemet; thej inte spelar en direkt roll i regleringen av hypofys-gonadfunktioner, liksom den välkända hypotalamus GnRH1 nervceller 2, 3. tonic mönster av spontan aktionspotential bränning av TN-GnRH3 neuroner är en inneboende egenskap 4-6, frekvensen varav moduleras genom visuella referenser från artfränder 2 och neuropeptid kisspeptin 1 5. I den här videon, använder vi en stabil linje av transgena medaka där TN-GnRH3 nervceller uttrycka en transgen innehållande promotorregionen av Gnrh3 kopplat till förbättrade grönt fluorescerande protein 7 för att visa dig hur man identifierar neurons och övervaka deras elektriska aktiviteten i hela hjärnan framställning 6.

Protocol

Ett. Dissektion av Brains från Adult Medaka Söva vuxen man eller kvinna (Figur 1A) genom nedsänkning i 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), vänta ett par minuter efter gälar rörelser har upphört innan halshugga. Alla förfaranden godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén av University of California-Los Angeles. Halshugga fisken i fisk saltlösning vid den kaudala änden av kapseln med en sax i en 60-mm diameter petriskål. Överför fisk huvud …

Representative Results

Ett exempel på bilaterala kluster av GFP-märkta TN-GnRH3 neuroner från den utskurna hjärnan hos medaka fisk visas i figurerna 1B och 1C. Varje kluster innehåller cirka 8-10 GnRH nervceller. De spontana neuronala aktiviteter målet TN-GnRH3 noterades i ström-clamp-läge (I = 0) med typiska bränning hastigheter av 0,5-6 Hz. Mönstret av aktionspotential bränning är vanligtvis en tonic eller slå mönster, med en ganska regelbunden interspike intervall. Exempel på spår visas i <…

Discussion

GnRH 3: GFP transgena fiskar ger unika modeller för att studera neurofysiologiska mekanismer bakom neuronal integration och reglering i central kontroll av beteenden som är både direkt och indirekt involverade i fortplantning 3, 8-10. En av de stora fördelarna med denna modell system är att många GnRH3 nervceller som uttrycker GFP är nära den ventrala ytan av hjärnan, vilket möjliggör relativt enkel tillgång till de nervceller för elektrofysiologiska inspelning utan att störa nervbanor …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Dr Meng-Chin Lin och Ms Yuan Dong för tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health HD053767 (underleverantör till NLW), samt genom medel från Institutionen för fysiologi och tjänstgörande rektor för forskning, University of California-Los Angeles (NLW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Olympus BX50W (Upright)
Amplifier Axon Instruments Axoclamp 200B
A-D converter Computer Interference Corp. Digidata ITC-18
Cooled CCD camera PCO Computer Optics Sensicam
Xenon lamp Sutter Instruments Co.
GFP filter set Chroma Technologies
Imaging Software Intelligent Imaging Innovations Slidebook software
Electrophysiology Data Acquisition Software Axon Instruments Axograph software
Electrophysiology Data Acquisition Software AD Instruments Inc. PowerLab
Headstage for electrophysiology Axon Instruments CV 203BU
Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-285
Recording Chamber Platform Warner Instrument Corp. P1
Recording Chamber Warner Instrument Corp. RC-26G
Electrode Puller Sutter instruments P87
Filament for electrode puller Sutter Instruments FB330B 3.0 mm wide trough filament
1.5 mm glass capillaries World Precision Instruments 1B150-4 Microelectrode for recording
Syringe Becton Dickinson 309586 3 ml
MS-222 Sigma E10521-10G Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt
Fish saline mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES
Electrode solution (loose-patch) mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose
Electrode solution (whole-cell patch) mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine

Referências

  1. Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
  2. Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
  3. Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
  4. Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
  5. Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909 (2012).
  6. Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
  7. Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  8. Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
  9. Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
  10. Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
  11. Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
  12. Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
  13. Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).
check_url/pt/50312?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. J. Vis. Exp. (74), e50312, doi:10.3791/50312 (2013).

View Video