Summary

Innspilling elektriske aktiviteten fra Identifiserte Nerveceller i Intakt Norgesmester Transgenic Fish

Published: April 30, 2013
doi:

Summary

I denne videoen vil vi demonstrere hvordan du tar opp elektrisk aktivitet fra identifiserte enkelt nevroner i en hel hjerne forberedelse, som bevarer komplekse nevrale kretser. Vi bruker transgen fisk hvori gonadotropinfrigjørende hormon (GnRH)-nevronene er genetisk merket med en fluorescerende protein for identifikasjon i den intakte hjerne preparatet.

Abstract

Forstå cellefysiologi av nevrale kretser som regulerer komplekse atferd er sterkt forbedret ved hjelp av modellsystemer der dette arbeidet kan utføres i en intakt hjerne forberedelse der nevrale kretser i CNS forblir intakt. Vi bruker transgen fisk som gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH) nevroner er genetisk merket med grønt fluorescerende protein for identifikasjon i den intakte hjerne. Fisk har flere populasjoner av GnRH-neuroner, og deres funksjon er avhengig av deres plassering i hjernen og den GnRH-genet som de uttrykker en. Vi har fokusert vår demonstrasjon på GnRH3 nevroner lokalisert i terminalen nerver (TN) forbundet med olfactory pærer bruker intakt hjernen av transgene medaka fisk (Figur 1B og C). Studier tyder på at medaka TN-GnRH3 nevroner er neuromodulatory, fungerer som en formidler av informasjon fra det ytre miljøet til det sentrale nervesystemet, tHei ikke spille en direkte rolle i å regulere hypofyse-/gonadesystemet funksjoner, som gjør den velkjente hypothalamus GnRH1 to nerveceller, tre. Den tonic mønster av spontan handling potensial avfyring av TN-GnRH3 nevroner er en iboende egenskap 4-6, frekvensen som er modulert av visuelle signaler fra conspecifics 2 og neuropeptide kisspeptin en fem. I denne videoen bruker vi en stabil linje av transgene medaka der TN-GnRH3 nevroner uttrykker et transgen inneholder promoter regionen Gnrh3 knyttet til forbedret grønt fluorescerende protein syv vise deg hvordan du kan identifisere nevroner og overvåke deres elektrisk aktivitet i hele hjernen forberedelse seks.

Protocol

En. Disseksjon av Hjerner fra Adult medaka Anesthetize voksen mann eller kvinne (figur 1A) ved å dyppe i 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), vent et par minutter etter at gjeller bevegelser har opphørt før decapitating. Alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee of University of California-Los Angeles. Decapitate fisken i fisk fysiologisk saltvann ved den caudale enden av operculum med saks i et 60 mm diameter petriskål. Transfer fisk hod…

Representative Results

Et eksempel på bilaterale klynger av GFP-merket tn-GnRH3 nerveceller fra utskåret hjerne killifisk av fisk er vist på figurene 1B og 1C. Hver klynge inneholder ca 8-10 GnRH nerveceller. De spontane nevrale målselskapets TN-GnRH3 ble registrert i current-klemme-modus (I = 0) med typiske avfyring priser på 0,5-6 Hz. Mønsteret av handlingen potensial avfyring er vanligvis en tonic eller banke mønster, med en ganske vanlig interspike intervall. Eksempel på spor er vist i fig…

Discussion

GnRH 3: GFP transgene fiskene gir unike modeller for å studere de nevrofysiologiske mekanismene bak neuronal integrering og regulering i sentral kontroll av atferd som er både direkte og indirekte involvert i tre reproduksjon, 8-10. En av de betydelige fordelene med dette modellsystemet er at mange GnRH3 nevroner uttrykker GFP seg i nærheten av den ventrale overflaten av hjernen, noe som muliggjør forholdsvis enkel tilgang til nervecellene for elektrofysiologisk registrering uten å forstyrre nev…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Dr. Meng-Chin Lin og Ms Yuan Dong for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health HD053767 (underentrepriser til NLW), og med midler fra Institutt for fysiologi og kontor Vice Chancellor for Research, University of California-Los Angeles (NLW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Olympus BX50W (Upright)
Amplifier Axon Instruments Axoclamp 200B
A-D converter Computer Interference Corp. Digidata ITC-18
Cooled CCD camera PCO Computer Optics Sensicam
Xenon lamp Sutter Instruments Co.
GFP filter set Chroma Technologies
Imaging Software Intelligent Imaging Innovations Slidebook software
Electrophysiology Data Acquisition Software Axon Instruments Axograph software
Electrophysiology Data Acquisition Software AD Instruments Inc. PowerLab
Headstage for electrophysiology Axon Instruments CV 203BU
Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-285
Recording Chamber Platform Warner Instrument Corp. P1
Recording Chamber Warner Instrument Corp. RC-26G
Electrode Puller Sutter instruments P87
Filament for electrode puller Sutter Instruments FB330B 3.0 mm wide trough filament
1.5 mm glass capillaries World Precision Instruments 1B150-4 Microelectrode for recording
Syringe Becton Dickinson 309586 3 ml
MS-222 Sigma E10521-10G Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt
Fish saline mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES
Electrode solution (loose-patch) mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose
Electrode solution (whole-cell patch) mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine

Referências

  1. Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
  2. Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
  3. Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
  4. Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
  5. Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909 (2012).
  6. Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
  7. Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  8. Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
  9. Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
  10. Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
  11. Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
  12. Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
  13. Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).
check_url/pt/50312?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. J. Vis. Exp. (74), e50312, doi:10.3791/50312 (2013).

View Video