Summary

Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von identifizierten Neuronen im intakten Gehirn von transgenen Fischen

Published: April 30, 2013
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Summary

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie die elektrische Aktivität von einzelnen Neuronen identifiziert in einer ganzen Gehirn Vorbereitung, die komplexe neuronale Schaltkreise bewahrt aufzeichnen. Wir verwenden transgene Fische in der Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) Neuronen genetisch mit einem fluoreszierenden Protein zur Identifikation der intakten Zubereitung markiert sind.

Abstract

Das Verständnis der Zellphysiologie von neuronalen Schaltkreise, die komplexe Verhalten regulieren stark verbessert, indem Modellsystemen in denen diese Arbeiten in einer intakten Zubereitung bei der neuronalen Schaltkreise des ZNS intakt durchgeführt werden kann. Wir verwenden transgene Fische in dem Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) Neuronen genetisch mit dem grün fluoreszierenden Protein für die Identifizierung im intakten Gehirn sind verschlagwortet. Fische haben mehrere Populationen von GnRH Neuronen und ihre Funktionen sind abhängig von ihrer Lage im Gehirn und dem GnRH-Gen, dass sie 1 auszudrücken. Wir haben unsere Demonstration am GnRH3 Neuronen in den Terminal Nerven (TN) mit den Riechkolben mit dem intakten Gehirn von transgenen Medaka Fisch (Abbildung 1B und C) verbunden befindet konzentriert. Studien zeigen, dass Medaka TN-GnRH3 Neuronen neuromodulatory sind, als ein Sender von der externen Umgebung des zentralen Nervensystems; they spielen keine direkte Rolle bei der Regulierung der Hypophysen-Gonaden-Funktionen, wie auch die bekannte Hypothalamus GNRH1 Neuronen 2, 3. Das Tonikum Muster der spontanen Aktionspotentiale Abfeuern von TN-GnRH3 Neuronen eine intrinsische Eigenschaft 4-6, die Frequenz von denen durch visuelle Hinweise von Artgenossen 2 und dem Neuropeptid kisspeptin 1 5 moduliert. In diesem Video, verwenden wir eine stabile Linie von transgenen Medaka in dem TN-GnRH3 Neuronen exprimieren ein Transgen enthält die Promotor-Region des Gnrh3 verknüpft enhanced green fluorescent protein 7, Ihnen zu zeigen, wie man Neuronen identifizieren und überwachen ihre elektrische Aktivität im gesamten Gehirns Zubereitung 6.

Protocol

1. Präparation der Gehirne von Adult Medaka Anesthetize erwachsenen männlichen oder weiblichen (Abbildung 1A) durch Eintauchen in 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4); warten Sie ein paar Minuten nach der Kiemen Bewegungen vor enthaupten aufgehört. Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der University of California-Los Angeles genehmigt. Enthaupte den Fisch in Fisch Kochsalzlösung am kaudalen Ende des Verschlusses mit einer Schere in einer 60…

Representative Results

Ein Beispiel für bilaterale Cluster von GFP-markierten TN-GnRH3 Neuronen aus dem Gehirn herausgeschnitten Medakafisches sind in den 1B und 1C gezeigt. Jeder Cluster enthält etwa 8-10 GnRH Neuronen. Die spontanen neuronalen Aktivitäten des Ziel-TN-GnRH3 wurden in Current-Clamp-Modus (I = 0) mit typischen Feuerraten von 0,5-6 Hz aufgezeichnet. Das Muster der Aktionspotential Brennen ist typischerweise ein Tonic oder gegen Muster, mit einer ziemlich regelmäßigen Interspike Intervall. …

Discussion

GnRH 3: GFP transgenen Fische bieten einzigartige Modelle, die neurophysiologischen Mechanismen neuronaler Integration und Regulierung in zentralen Steuerung von Verhaltensweisen, die sowohl direkt als auch indirekt in der Reproduktion 3, 8-10 beteiligt sind studieren. Einer der wesentlichen Vorteile dieses Modells besteht darin, dass viele GnRH3 Neuronen, die GFP in der Nähe der ventralen Oberfläche des Gehirns sind, so dass für relativ einfachen Zugang zu den Neuronen für elektrophysiologische …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Herrn Dr. Meng-Chin Lin und Frau Yuan Dong für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health HD053767 (Unterauftrag NLW) und durch Mittel aus dem Institut für Physiologie und Büro des Vizekanzlers für Forschung, University of California-Los Angeles (NLW) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Olympus BX50W (Upright)
Amplifier Axon Instruments Axoclamp 200B
A-D converter Computer Interference Corp. Digidata ITC-18
Cooled CCD camera PCO Computer Optics Sensicam
Xenon lamp Sutter Instruments Co.
GFP filter set Chroma Technologies
Imaging Software Intelligent Imaging Innovations Slidebook software
Electrophysiology Data Acquisition Software Axon Instruments Axograph software
Electrophysiology Data Acquisition Software AD Instruments Inc. PowerLab
Headstage for electrophysiology Axon Instruments CV 203BU
Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-285
Recording Chamber Platform Warner Instrument Corp. P1
Recording Chamber Warner Instrument Corp. RC-26G
Electrode Puller Sutter instruments P87
Filament for electrode puller Sutter Instruments FB330B 3.0 mm wide trough filament
1.5 mm glass capillaries World Precision Instruments 1B150-4 Microelectrode for recording
Syringe Becton Dickinson 309586 3 ml
MS-222 Sigma E10521-10G Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt
Fish saline mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES
Electrode solution (loose-patch) mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose
Electrode solution (whole-cell patch) mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine

Referências

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Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. J. Vis. Exp. (74), e50312, doi:10.3791/50312 (2013).

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