的分散Presomitic中胚层细胞培养的斑马鱼分割时钟在单细胞成像代

1，解剖前上剥离的前一天，从斑马鱼对杂合的转基因等位基因的incross获得胚胎。 提高在E3媒体胚胎无亚甲蓝在28 O C，直到盾阶段（6小时后受精）。 在没有亚甲基蓝，以20°CO / N的E3媒体转移胚胎在20℃时 ，胚胎就会形成每个小时1体节一旦达到tailbud阶段。经过17-20小时O / N为20℃，胚胎应该在5〜8体节期在第二天早上在解剖协议的开始。 装配工具和所需的解剖试剂。 火抛光的玻璃吸管的胚胎和组织转移一双细镊子去除绒毛膜从胚胎的Sylgard涂层35毫米的菜解剖 – 倾的Sylgard聚合物为35毫米的菜和治愈O / N在37°C。使夹层以及用针尖除去少量固化的聚合物。烹调，可清洗，随后再利用。 削尖，扁平的PSM组织操纵钨丝工具微型手术刀切割所需的片PSM的文化 35毫米的塑料培养皿培养胰蛋白酶含有10％胎牛血清的L15培养基 0.25％胰蛋白酶/ EDTA溶液为分散Sigmacoted凝胶加载提示塑料培养皿中含有E3介质中无亚甲基蓝。 覆盖玻璃底培养皿的成像与Fibronectin1衬底（在PBS中的10微克/毫升）。离开盘上板凳外套夹层中。 使用立体镜适当的荧光过滤器来识别和排序阳性转基因胚胎（5〜8体节期）。 通过检查presomitic中胚层（PSM）用于YFP的表达下荧光通道（ 图1A）鉴定转基因胚胎。荧光笑ULD可见在该地区从上形成体节的tailbud。选择胚胎各路信号;后代的25％应携带2份转基因的纯合子胚。需要确定胚胎的数量变化的基础上的实验。一个解剖tailbud片将产生1,000个细胞的平均值。通常情况下，一些额外的积极胚胎的情况下错误的解剖过程中进行了有益的。 使用透射光作为位置基准来区分任何自发荧光，尤其是在卵黄细胞，从信号。 积极转移胚胎到含有E3介质中无亚甲蓝一个单独的塑料培养皿中。 2，PSM解剖和扩散准备胚胎解剖。 在解剖显微镜下，用细镊子，小心地从在E3媒体每个胚胎取出绒毛。请务必不要损坏胚胎或破坏卵黄细胞。 </l我> 填写的Sylgard涂层解剖盘与L15培养基中的血清。使用镊子或其他平坦的工具，从的Sylgard的表面除去任何气泡。 用火抛光的玻璃吸管的解剖盘转移dechorionated胚胎。 使用线工具，将所有的胚胎的解剖盘的一侧。 从单个胚胎解剖的PSM。 东方在其横向侧面的单个胚胎的小的解剖盘（ 图1B）内的Sylgard层以及制成。 通过胚胎和卵黄细胞用微手术刀，切片只是前向后脑和通过胚胎（ 图1B，红色虚线）的腹杆。 取下前片胚胎从井中，移开，在盘子的一边，然后用线工具从后段包括PSM刮去剩余卵黄细胞颗粒。 一旦蛋黄已经被刮掉，压平及定向PSM与前端指向远离实验者和后部朝向实验者（ 图1C）。 若该薄层外胚层尚未由这点被拉断，可使用线工具剥离它远离PSM组织的顶部。 使用微型手术刀切开tailbud，PSM的最后尖过去脊索的末端，远离所述组织（ 图1C，红色虚线）的其余部分。注意：其他组织片从PSM，例如前PSM接近最后形成的体节，也可以考虑到培养，取决于实验问题。 移动tailbud片的菜远离解剖区域的一角。使用线工具来清除解剖领域的任何碎片和不必要的胚胎组织。 重复与下一个胚胎。 池tailbud件由多个电子mbryos，这取决于有多少细胞将需要进行实验。平均而言，单件tailbud组织产生1,000个细胞。 填补空白的35毫米塑料盘具有体积小胰蛋白酶-EDTA的。 用火抛光的玻璃吸管，从解剖盘到含有胰蛋白酶/ EDTA盘转移tailbud件。孵育tailbud条胰蛋白酶/ EDTA进行20分钟，在室温。 当组织被培养在胰蛋白酶，从玻璃底培养皿的成像取出Fibronectin1溶液。 玻璃与超纯水冲洗液3次。使用抽吸去除每次洗涤，并确保菜是完全干燥。 分散tailbud枚介质成像。 吸取100微升L15培养基与血清成影像菜。 使用凝胶涂层尖，从胰蛋白酶/ EDTA在尽可能小的体积尽可能去除tailbud件。 移液器的tailbud片放入在培养基中成像菜。移液器件上下多次打破他们分开，并暂停在细胞培养基中。注意不要引入气泡。检查在显微镜下的细胞团块，并根据需要分散更多。 允许分散的细胞在悬浮液中沉降到Fibronectin1被覆玻璃20分钟，在RT。 开始成像之前添加少量额外L15培养基用无血清的细胞。使用时注意不要破坏结算细胞。 由于实验的问题，任何补充或药物治疗添加到文化。 分散PSM细胞3。成像设立成像盘中低温试验箱的时间推移成像显微镜。设置华纳室的实验所需的温度。让菜开始图像采集前平衡至少30分钟。交叉检验温度与外部温度探头放入盘中，如果需要的话。注：由于温度和体节形成率21稳定的温度控制之间的关系为周期的在单一的PSM细胞的精确测量是必不可少的。 收购的荧光通道测试图像，检查曝光时间和增益，可提供强度的大动态范围，而不饱和度，以确保良好的信号噪声水平。使用该协议从我们的线路产生分散的细胞获得一个典型的荧光图像需要400毫秒和40毫秒的透射光图像与EMCCD相机在85的EM增益运行。另外，前置放大器增益和读出速度从摄像头也是必不可少的了最大化的噪声信号。 采用透射光通道中，选择单元格的时间推移采集领域。 运行的时间推移获取协议的时间所需要的长度。 获取一个透射光，每个字段的一个荧光图像。注：设置采集RO之间的间隔unds，将捕获时间动态没有光漂白过的细胞扩展成像或诱导毒性。该协议使用一个2分钟的间隔。 记录以确保电池保持在对焦，任何软件或硬件错误等时偶尔检查时间推移建立 4，图像的收购时间推移电影处理在图像处理软件，后天野外露天电影文件。注：斐济被用于所有的处理在此协议。 拆分透射光和荧光帧从一个字段创建2堆栈的图像。 跟踪单个细胞在透射光通道。 将一个圆形的ROI（感兴趣区域），选定的单元格周围在透射光通道的第一帧。注意：只有细胞，1是健康的在录音结束后，2不要领域的移动之外，和3不接触到其他CE接触。LLS被跟踪。 除投资回报率每隔几帧的投资回报率经理。跟踪单元格，直到最后一帧。 使用上的荧光通道保存的ROI测量强度。 选择荧光堆栈和与保存的感兴趣区，使用定制的圆圈内插器插件和宏来测量跟踪的细胞随时间的强度。 检查输出跟踪从宏观。如果跟踪定性地捕捉荧光延时功能，输出值到Excel工作表。 除投资回报率清单的细胞。 重复跟踪传输信道并测量荧光信道用于其它细胞的字段。 从实验重复其他字段的所有步骤。