انتقائية للبحث عن المفقودين من ألياف العصب السمعي في الطيور الدهليزي القوقعي الجنينية
Summary
نحن هنا وصف تقنية تسليخ مجهري تليها حقن صبغة الفلورسنت في العقدة الصوتية للأجنة الكتكوت المبكر للانتقائية تتبع من ألياف المحور العصبي السمعي في الدماغ المؤخر والعصب.
Abstract
فرخ الجنينية هو نموذج يستخدم على نطاق واسع لدراسة الطرفية والمركزية التوقعات خلية العقدة. في الجهاز السمعي، ووضع العلامات الانتقائي للمحاور عصبية السمعية داخل العصب القحفي VIIIth تعزيز دراسة السمعية المركزية التنمية الدائرة. هذا النهج من الأمور الصعبة نظرا الحواس متعددة من الأذن الداخلية والعصب المساهمة في VIIIth 1. وعلاوة على ذلك، علامات التي تميز بشكل موثوق السمعية مقابل مجموعة من المحاور العصبية الدهليزي داخل العصب VIIIth الطيور لا يزال يتعين تحديدها. لا يمكن السمعية والدهليزية مسارات يمكن تمييزها وظيفيا في الأجنة في وقت مبكر، كما الحسية استجابات ليست موجودة قبل تشكيل الدوائر. وقد تتبعت إسقاط مركزيا بالخلايا العصبية VIIIth في بعض الدراسات، ولكن رافق السمعية محور عصبي وضع العلامات من قبل المكونات الأخرى من وضع العلامات العصبية VIIIth 2،3. هنا، نحن تصف طريقة لتتبع تقدمي من العقدة الصوتية لابي انتقائيمحاور عصبية ل السمعية داخل العصب VIIIth النامية. الأولى، بعد تشريح جزء من المنطقة الأمامية من الرأس الجنين الفرخ يوم 8-منغمسين في الاوكسيجين السائل النخاعي الاصطناعي، تم تحديد قناة القوقعية من المعالم التشريحية. المقبل، يتم وضع غرامة micropipette الزجاج سحبت لحقن كمية صغيرة من الأمينات رودامين ديكستران في المنطقة العميقة لاصق والمجاورة حيث توجد خلايا العقدة الصوتية. في غضون ثلاثين دقيقة بعد الحقن، وتتبع محاور عصبية السمعي في الدماغ المؤخر مركزيا ويمكن أن تكون في وقت لاحق بعد إعداد تصور نسيجية. هذا الأسلوب يوفر أداة مفيدة للدراسات الإنمائية من الطرفية إلى وسط السمعية تشكيل الدائرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
واقتصرت دراسات التنمية في وقت مبكر من العصب VIIIth ويرجع ذلك جزئيا لصعوبة في تحديد محاور عصبية الجنينية الناجمة عن العقد متميزة متعددة. واستكشفت عدة دراسات الإشارات الجزيئية والخلايا السمعية توجيه الحسية الدهليزي ومصائر خلية العقدة خلال التنمية في وقت مبكر، ولكن 5،…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر الدكتور كانديس هسيه للحصول على اقتراحات والمساعدة مع تقنيات التصوير والدكتور وو دوريس لخبرة في التشريح فرخ الأذن الداخلية خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر. وأيد هذا العمل من قبل NSF-IOS 0642346، NIH-T32 DC010775، NIH-T32 GM008620، NIH-R01 DC010796، وDOE GAANN P200A120165.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
| Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
| NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
| KCl | Various | part of aCSF recipe | |
| KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
| Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
| CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
| MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
| Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
| Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
| Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
| Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
| Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
| 50 ml Beaker | various | ||
| Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
| Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4″ (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
| Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
| Micromanipulator | Narishige | various | |
| Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
| 4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
| anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
| Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
| Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |
Referências
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139, 245-257 (2012).
- Pflieger, J. F., Cabana, T. The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica. Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).
- Molea, D., Rubel, E. W. Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion. The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).
- Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).
- Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
- Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick’s cochlea. Hearing Research. 56, 211-226 (1991).
- Code, R. A. Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick. Hearing Research. 82, 26-30 (1995).
- Maklad, A., Fritzsch, B. Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets. Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification. Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).
- Appler, J. M., Goodrich, L. V. Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly. Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).
- Bulankina, A. V., Moser, T. Neural circuit development in the mammalian cochlea. Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).
- Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages. Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).
- Marrs, G. S., Spirou, G. A. Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem. The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).
- Milo, M., et al. Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear. PloS One. 4, e7144 (2009).
- Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).
- Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain. Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).
- Huang, E. J., et al. Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons. Development. 128, 2421-2432 (2001).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).
- Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).
