שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em> בvivo</em
Summary
הפיתוח האחרון של כלים מדעי המוח המשלבים גנטיקה ואופטיקה, המכונה "optogenetics", מאפשר שליטה על פעילות מעגלים עצבית ברמה חסרת תקדים של רזולוציה מרחב ובזמן. כאן אנו מספקים פרוטוקול לשילוב בהקלטה vivo עם המניפולציה optogenetic של תת קבוצות גנטית מוגדרות של תאי עצב בקליפת המוח פירמידה וsubicular הקדם חזיתית.
Abstract
שיטות optogenetic צמחו ככלי רב עוצמה להבהרת פעילות מעגלים עצבית שבבסיס קבוצה מגוונת של התנהגויות במגוון רחב של מינים. כלים optogenetic ממוצא חיידקים מורכבים מחלבוני קרום רגישים לאור, כי הם מסוגלים להפעיל (למשל, channelrhodopsin-2, ChR2) או שתיקה (למשל, halorhodopsin, NpHR) סוגי תאי ingenetically מוגדרי פעילות עצבית על לוחות זמני התנהגותית רלוונטיים. אנחנו הראשונים להפגין גישה פשוטה למסירה בתיווך הווירוס adeno הקשורים של transgenes ChR2 וNpHR לsubiculum הגבי ואזור prelimbic של קליפת המוח הקדם חזיתית בחולדה. בגלל ChR2 וNpHR מבחינה גנטי להכוונה, אנו מתארים את השימוש בטכנולוגיה זו כדי לשלוט בפעילות החשמלית של אוכלוסיות ספציפיות של נוירונים (כלומר, תאי עצב פירמידלי) משובצות ברקמה הטרוגנית עם דיוק גבוה זמני. אנו מתארים בזאת חומרה, תוכנה מותאמת אישיתממשק משתמש, ונהלים שיאפשר למסירה בו זמנית אור ורישום חשמלי מתאי עצב פירמידלי transduced בהרדימו בהכנת vivo. כלים אור מגיב אלה מספקים ההזדמנות לזיהוי התרומות סיבתי של סוגי תאים שונים לעיבוד מידע והתנהגות.
Introduction
היכולת להפעיל או להשתיק את סוג תא מסוים בתוך מעגלים עצביים באופנת temporally מדויקת היא קריטית להבנת מעגלים עצביים לעבד סוגים שונים של מידע שבבסיס רגש וקוגניציה. שליטה ניסויית על פעילות עצבית שלמה העסיקה כלים loss-/gain-of-function (למשל, גירוי חשמלי, אפנון תרופתי, נגע) שאינו מספקים את הנדרש באופן סלקטיבי לשליטה באוכלוסיות ספציפיות של תאי עצב, או על היקף זמן או בחלל. ישירות מענה לאתגרים הטכנולוגיים אלה, הפיתוח והיישום של כלים רגישים לאור גנטי encodable אפשר מדעני מוח כדי לשלוט בפעילות החשמלית של סוגים בחרו תא במהלך אירועים התנהגותיים מוגדרים היטב. רבים מחלבונים רגישים לאור אלה הם ממוצא חיידקים, עם הערוץ מגודרת אור קטיון, channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, ואת משאבת כלוריד מונחה האור, halorhodopחטא (NpHR) 2,3, בשימוש נרחב.
יתרון עיקרי של optogenetics הוא יכולת אוכלוסיות תאים גנטי יעד ספציפי באזורי המוח הטרוגנית והטכניקה יושמה בהצלחה למספר אורגניזמים מודל (חסרי חוליות לפרימטים לא אנושיים) 4-6. בעלי חיים מהונדסים optogenetic רבים כבר נוצרו וזמינים 7,8 מסחרי, קווים מהונדסים זאת הקמת יכולים להיות עבודה אינטנסיבית ועלות אוסרני. כאן אנו מתארים פרוטוקול למסירה באופן ויראלי בתיווך של גנים ChR2 וNpHR תחת אמרגן CaMKIIα בקליפת מוח עכברוש prelimbic וsubiculum גב באמצעות וירוס adeno הקשורים רקומביננטי וקטור (AAV). בתוך המוח הקדמי, ביטוי CaMKIIα הוא בלעדית לנוירונים פירמידליים glutamatergic 9. AAV משמש בדרך כלל למחקר בסיסי בשל קלותו היחסית של ייצור וחוסר פתוגניות, כמו גם החזק וPersiביטוי transgene סטנט שהושג עם הווקטורים האלה 10. בנוסף אנו מתארים את הצעדים וחומרה למסירה בו זמנית אור והקלטה בחולדות קבוע בראש בהרדמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מגוון רחב של טכניקות זמינים עבור גנטי מיקוד גנים opsin חיידקים לאזורים במוח בדיד במכרסמים. משלוח גנטי נגיפי מספק גישה זולה יחסית ומהירה לתיווך ביטוי ChR2 וNpHR עם סגוליות סוג התא. מערכות וקטור AAV הן בחירה נפוצה לשימוש בניסויי optogenetic בשל כותרות ייצור גבוהות שתישארנה יציב במהלך אחסון, חוסר פתוגניות שלה, ויכולתה לייצר ביטוי גנים לטווח ארוך 10. רבים ממבני opsin עם יזמים תאים מסוג מסוימים זמינים באופן מסחרי במגוון רחב של קפסיד AAV ממתקני גרעין וקטור כגון אוניברסיטת פנסילבניה (http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore) או האוניברסיטה צפון קרוליינה בצ'אפל היל (http://genetherapy.unc.edu). חסרון אחד לטכנולוגיית AAV הואקיבולת מוגבלת אריזה (~ 4.7 kb), אשר מציבה מגבלה על גודל קלטת transgene שיכול לשמש למיקוד ספציפי בתא. כחלופה, וקטורי lentiviral, שיש להם יכולת אריזה גדולה יותר, מסוגלים להכיל opsin מיקוד בשליטה של רצפי אמרגן גדולים יותר.
השימוש בoptrode מאפשר זיהוי אמין של אותות אלקטרו בשילוב עם משלוח אור temporally המדויק. כפי שתואר לעיל, עם זאת, יש צורך בטיפול מספיק בבנייתו. מאז הסיבים אופטיים ביקע הוא שברירית, קשירת חוט התפר חזקה מדי עלולה לגרום לסיבים לשבור. למרות optrode יכול לשמש להקלטות מרובות, את האלקטרודה וסיבים אופטיים יש לנקות (או באופן ידני ביקע במקרה של הסוף החשוף הסיבים אופטיים) לקראת כניסה בגלל העכבה של האלקטרודה ואיכות האור נמסר תהיה לבזות עם שימוש חוזר.
במהלך eleהקלטות ctrophysiological חשובה שoptrode להיות מתקדמת לאט. יש optrode משמש כאן כ 350 עובי מיקרומטר (אלקטרודה טונגסטן: 125 מיקרומטר; ליבה של סיבים אופטיים: 200 מיקרומטר) והוריד אותו במהירות יכולה להוביל לתנועה של רקמת המוח. חפצי אור מושרה גם עשויים להיחשב עם הקלטה מסוימת ולהגדיר קופצים משלוח אור 11-12. למרות שאנחנו לא מצאנו שום חפץ מושרה אור בתנאי הניסוי שלנו, הקלטות מחוץ לאזור המוח transduced עלולים לשמש כביקורת לחפצים קלים. שיקול נוסף בתהליך ההקלטה הוא עוצמת אור הנדרשת להתבוננות שינויים בנוירונים ChR2 או NpHR-להביע, במיוחד עבור הקלטות משך זמן רב. עוצמת לייזר חזקה ותאורת לייזר ארוכה עלולות לגרום לניזק לרקמות ו / או תגובת ירד לאור נמסר שלאחר מכן 12-13. לניסויים התנהגותיים השימוש בוקטור ויראלי בקרה נדרש לeliminatinגרם כל השפעה עקב חום מועבר מהסיבים. עבור רבים ממבני optogenetic הזמינים המסחרית יש מבני שליטה משלימים שבהוסר רצף גן opsin.
יש לציין כי מהונדס ChR2 גרסאות עם מאפיינים וקינטיקה השתפרו פותחו יחד עם opsins השתקה אחר שעשויה להיות מתאים יותר לשאלות ניסיוניות מסוימות 14-15. לדוגמא, גרסת ChR2 חדשה שהוקמה באמצעות mutagenesis הממוקד, המכונה "ChETA", יכול לנהוג spiking העצבי באיכות גבוהה בתדרים (עד לפחות 200 הרץ) מעל זה של ChR2 המקורי 14.
השילוב של in vivo משלוח אור והקלטה בו זמנית של תגובות עצביות הוא שלב קריטי בהקמת מערכות יחסים סיבתי בין פעילות בדוגמת באוכלוסיות תאים גנטית ממוקדים ואירועים התנהגותיים זמן נעול מקביל. הנהלים וחהrdware המתואר כאן מספק גישה פשוטה ליישום optogenetics לin vivo הקלטות קבוע בראש במכרסמים.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לשימוש בסמים (NIDA) המענק R01 DA24040 (DCC), גרנט זרע חדשני אוניברסיטת קולורדו (DCC), ומענק הכשרת NIDA T32 DA017637 (MVB).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl |
| Removable Needle | Hamilton | 7803-03 | 31 gauge, beveled tip |
| Microinjector Pump | World Precision Instruments | UMP3 | |
| Pump Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| Silicone Oil | Alfa Aesar | A12728 | |
| Laser Protective Eyeware | Kentek | KMT-4501 | |
| Multimode Optical Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm diameter core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T12S21 | for 200 μm diameter core multimode fiber |
| Optical Power Meter | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
| Photodetector | Newport | 818-SL/DB | |
| Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
| Green Laser (532 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
| Tungsten/Fiber Optrode | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | Lumitrode |
| Glass Capillary Tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MO-22 | |
| Amplifier | Kation Scientific | ExAmp-20K | |
| Data Acquistion Device | National Instruments | NI USB-6009 | |
| Rodent Head Restraint for Recording | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
| Small Animal Stereotaxic Unit | David Kopf Instruments | Model 963 |
Referências
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2 (3), e299 (2007).
- Zhang, F., Wang, L. P., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
- Han, X. Optogenetics in the nonhuman primate. Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).
- Zhao, S., Ting, J. T., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing. Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).
- Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system. Neurociência. 46 (4), 825-849 (1992).
- McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS. Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).
- Cardin, J. A., Carlen, M., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).
- Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
- Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
- Chow, B. Y., Han, X., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).
