多重ケモスタットアレイの設計および使用
Summary
我々が開発し、低コストで容易に入手できる部品から構築ミニチュアケモスタットのフットプリントの小さい配列を検証されています。生理学的および実験的な進化の結果は、大きなボリュームケモスタットに類似していた。 ministatアレイは、従来のケモスタット実験、機能ゲノミクス、化学スクリーニングアプリケーションのため、コンパクトで安価、かつアクセス可能なプラットフォームを提供します。
Abstract
ケモスタットは、細胞を培養密度は、特定の栄養素を制限することによって制約されて厳密に制御され、化学的に一定の環境に成長させた連続培養システムです。ケモスタットから1,2のデータは、それらが一定の成長率を提供するように定量的な表現型を測定するための非常に再現性がある定常状態で、環境。これらの理由から、ケモスタットは、遺伝子発現3-6および定常均衡における文化の他の特性の分析による生理機能の微細特性評価のために有用なツールとなっています。ケモスタット7長期実験は微生物集団が採用する特定の軌跡を強調表示することができます制御された環境での適応進化の過程。実際には、ケモスタットは、その発明以来、実験的な進化のために使用されている。8進化実験における一般的な結果は、されている各生物の複製のために突然変異のユニークなレパートリーを取得する。9-13は、この多様性は、はるかにはるかに大きなスループットと進化実験を行うことによって発見されるようにそこに残っていることを示唆している。
我々はここでミニチュアケモスタットまたは比較的単純な、低コストのアレイの設計と動作提示ministatsを、生理学の決定において、酵母による進化実験におけるそれらの使用を検証します。このアプローチは、ケモスタット数十単一の多重化蠕動ポンプをオフに実行の成長を伴います。文化は、様々な用途のために実用的である20ミリリットル作業容積に維持されています。これは、経費を減らし、スループットを向上させることを願っていますし、詳細な建物と操作指示を提供することにも機能的に株、種、成長パラメータの多数を特徴付けるための一般的なプラットフォームとして、このデザインの研究と産業応用のやる気を引き出すだけでなく、遺伝的なことがまたは薬物ライブラリ。
Introduction
微生物の成長と進化の原動力は微生物学、生態学、遺伝学、バイオテクノロジーの基礎である。培養微生物の最も一般的な方法は、細胞が栄養豊富な培地に低密度で接種し、飽和状態に栽培されているバッチである。標準的な実験装置を使用して実行することは簡単だが、バッチ培養は、変動の化学的環境を体験し、それに応じて、細胞生理を変える。この異種の生育環境は、二次成長と微妙な生理的な違いを隠すことができるストレスの影響をもたらすことができます。シリアルバッチ転送による実験的進化は特定の選択条件に適応を接続しようとする試みを複雑にし、成長期特有の亜集団の複雑な混合物のために選択することができます。定量的な表現型の測定は、ラグタイムなどの機能で不正確なサンプルタイミングとバリエーションからノイズに起因する困難になる可能性があります。連続培養は、代替手段を提供細胞が再現生理定常状態に到達するために定義された成長率で化学的に均質な環境で栽培することができる成長レジーム。これらの利点により、細胞の状態の実験的進化と特性評価の研究はしばしばケモスタットのように連続培養の制御された環境を利用しています14
これらの利点の増価はケモスタット文化への関心の復活につながっている。15 1950年の発売以来、1,2ケモスタットシステムはリットルからマイクロリットルに至るまで様々なスケールで、様々なアプリケーションを機能させるために開発されてきた16シェアは、商業的に生産バイオリアクターからglassblown船舶へのカスタムマイクロ流体プラットフォームへの一般的な設計原則の範囲-19これらの様々なデザイン、。培養室を攪拌し、通気し（通常はそれを介して空気をバブリングすることによって）、その中に含まれる微生物は均質保持されているLyはすべての回で、培養室全体に分散。定義された組成の新鮮な培地を継続的に追加され、添加速度は、成長率を制御し、文化が経験した化学的環境に影響を与えている。オーバーフローが成長チューブ内培養液量を設定し、このオーバーフローによって文化を新鮮な培地が入ったときと同じレートでサンプリングされます。このように文化はすぐに多くの生物学的パラメータが一定のままでいる生理定常状態に達する。ケモスタットや文学では、これらのさまざまなプラットフォームでのレポートの利点にもかかわらず、広範な普及は、これらのシステムの構築と運用の難しさ、および商用オプションに伴う高コストによって制限されています。さらに、これらのデバイスを作成し、使用する方法の説明が不透明であることができる。
私たちは、デザインと低コストで容易に入手できる部品から構築ミニチュアケモスタットのフットプリントの小さい配列の使用説明書を提示します。我OBS大きなボリュームの商用バイオリアクターで培養した酵母のための報告されたデータへの我々のデバイスを比較する際に非常に一貫性のある実験パラメータと再現性のある結果をerve。これは10から15世代以内定常状態平衡に達すると平衡状態で似たような文化の密度を得ることを通じて見られるように、細胞生理の再現性を備えている。さらに、遺伝子発現パターンはministatsや商業大音量のプラットフォーム間で一貫しています。 3複写文化間の希釈率、光学濃度および遺伝子発現の再現性の安定性は、当社のプラットフォームの堅牢性を実証している。また、同じ適応変異が大きく、ボリュームケモスタットと同様に同様の実験進化の時間スケールで起こることを示している。
Protocol
Representative Results
Discussion
任意ケモスタットと同様ministatsでケモスタット培養は、詳細およびトラブルシューティングに注意を払う必要があります。汚染が連続培養実験における大きな関心事であるので、我々は一般的に長期的な進化実験中に接種し、すべての50世代によって細菌および真菌汚染のために顕微鏡を介して見える。これまでに我々はより大きい300世代の96進化実験（データは示さず）にわたって汚染は確認されていません。 ministats、我々は他のすべてのministatが上記のように酵母を接種した、残りは任意の培養を接種していなかったような16 ministatsを走った廃液ラインを経由して、培養室にコロニーを形成する微生物の可能性との間のクロスコンタミネーションをテストします。培養物は、一日おきに空にされた共同体廃棄物容器に採取した。汚染物質が排水ラインを介して入力することが可能であった場合、このように我々は、おそらく認められていたであろうこのexperimでENT。我々が外の酵母または他の微生物からの汚染がの実験で発生する可能性が低いことを示唆し、非接種ministat培養管の成長を観察していない接種と非接種文化のこの市松模様の3週間と成長の100世代よりも大きい時に類似のタイムフレーム。
ministatsが商業ケモスタットに類似した方法で動作するように設計されていたが、この配置のモジュール性は、最適化のために、ユーザーのニーズと予算に合わせてすることができます。このプロトコルに使用される蠕動ポンプは0.0186体積/時間〜3.6体積/時間（データは示さず）との間の流量を達成することができます。希釈率の増加制御が代替ポンプモデルを達成できた。低い希釈率での動作が可能になり、液滴配達の同じ周波数を達成するために、より高いゲージの針の置換を必要とするかもしれないことに注意してください。人口規模では、進化実験を適切に設計するための重要な考慮事項です。ここで使用される標準的な希釈率と栄養塩濃度は、公開され進化の研究と同程度の大きさの比較的大きな人口規模（約10 9個の細胞）を提供しています11もっと大きくしたり、小さくしたり集団が作業容量を変更したり、栄養塩濃度を制限することによって維持することができた。増加した変異供給も上昇突然変異率を有する株を操作することで得ることができた。
ministatsはまた私達の現在の設計で改善することができた。インスタンスの縮合に関しては培養チューブの壁に収集することができ、大幅に深い水浴、インキュベーター、または恒温室を使用することで軽減することができます。凝集と硫酸限られた文化の壁の伸びは300世代（データは示さず）、界面活性剤の様々な方法によって48分の5進化実験に現れる、比較的まれであるように見えるけれども、この特性を減少または遅延させるのを助けることができることを提供しています。凝集が十分な文化を妨害した場合には混合、攪拌増加は、各空気ポンプが分割されている方法の数を減らすことによって、または攪拌装置を追加することで実現できます。溶存ガス濃度、pH、または他のパラメータの追加のプローブにもいくつかの他のデザインのように、含まれる可能性があります。17
大きい容積の商業ケモスタットための報告データに我々のデバイスを比較するときに、このプロトコルに記載されているようministatsを使用して潜在的な変更にもかかわらず、我々は非常に一貫性のある実験パラメータと再現性のある結果を観察した。これは10から15世代（ 図2A）内に定常状態平衡に達すると平衡状態で似たような文化の密度を得ることを通じて見られるように、細胞生理の再現性が含まれていた。遺伝子発現パターンは、3つの生物間で一貫していた鉄代謝遺伝子を除いて、ministatsとministatsや商業大容量のプラットフォーム（ 図2B）の間で複製されます。これらのEXPressionの違いはおそらく2つのデバイスまたはメディア食材の質の向上の金属含有量の変化によって引き起こされます。我々のデータはministatsが一貫した環境が必要とされる生理または競合実験に有用であろうことを示唆している。
ministatデザインは、我々は250の世代のために硫酸塩制限下の文化を発展し、SUL1座の増幅を特徴づけるために、CGH用いた実験進化の用途には十分であるかどうかをテストするために- 。大きなボリュームケモスタットでこれらの条件の下での長期的な進化の特徴10我々は観察硫酸限られたメディアで4月4日の独立した進化実験（ 図2C）からクローンにおけるSUL1の増幅。全体として見ると、これらのデータはministatsは、伝統的なケモスタットの様々なアプリケーションに有用であり得る堅牢なプラットフォームであることを示唆している。我々は培養出芽酵母におけるそれらの使用を実証していますが、ministatsはすべきまた、実際に培養細菌や他の酵母種のために使用されている他の生物と同じような設計と互換性がある。16,17,25さらに小さく培養容量とメディアのための必要性が減少した相関が必要な実験のためにministatsに魅力的な代替手段を行うことができる高価なまたはエキゾチック試薬は、化学的または遺伝子スクリーニングの場合することができます。
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ビデオの作成は、研究資源のためのナショナルセンター（5P41RR011823-17）と米国立衛生研究所（NIH）から一般医科学研究所（8 P41 GM103533-17）からの補助金によって支えられている。この作品はまた、NSFの助成金1120425によってサポートされていました。 MJDはリタ·アレン財団奨学生です。 AWMはNIH T32 HG00035によって部分的にサポートされています。我々は、改善のプロトコルと支援のためにアンナ·サンシャインに感謝します。さらに、当社はministatsの初期ユーザーとしてサラDiRienzi、セリアペイアン、とエイミーSirrを認める。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 3/32″ x 7/32″ silicone tubing | VWR | 63009-260 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
| 1/2″ x 5/8″ silicone tubing (extra large) | VWR | 63009-299 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
| 1/4″ x 3/8″ silicone tubing (medium) | VWR | 63009-279 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
| Orange green marprene pump tubing | Watson-Marlow | 978.0038.00+ | Tubing: Order: 6x(pack of 6) |
| Female luer, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45500-04 | Connectors: Order: 4x(pack of 25) |
| Male luer lock, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45503-04 | Connectors: Order: 1x (pack of 25) |
| Reducing connector, PVDF, 1/4″ to 1/8″ | Cole Parmer | EW-30703-50 | Connectors: Order: 1x (pack of 10) |
| Barbed Y connector, 1/8″ ID | Cole Parmer | HV-30703-92 | Connectors: Order: 3x(pack of 10) |
| Medium tubing clamps | VWR | 63022-405 | Clamps: Order: 1x(pack of 12) |
| Day Pinchcock (metal clamp for tubing) | VWR | 21730-001 | Clamps: Order: 1x(pack of 10) |
| Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. | Fisher | 05-112-39 | Connectors: Order: 1x(pack of 25) |
| Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene | Fisher | 05-112-37 | Connectors: Order: 1x(pack of 5) |
| Silent Air Pumps | Aquarium Guys.com | 212422 | Air Supply: Order: 4 pumps |
| PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration | Cole Parmer | HV-02915-22 | Air Supply: Order: 1x(box of 100) |
| 1L Flask with sidearm | Fisher | 10-181F | Air Supply: Order: 2x(Pack of 6) |
| #8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks | Fisher | K953715-0801 | Air Supply: Order: 8 stoppers |
| 4-Port manifold | Cole Parmer | EW-06464-85 | Air Supply: Order: 8 manifolds |
| 55 ml Screw cap culture tubes | Corning Life Sciences | 9825-25 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48) |
| Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line | Fisher | 14-817-105 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
| Spinal tap needle | VWR | BD40836 | Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10) |
| Regular hypodermic pink needle | Fisher | 14-817-104 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
| Foam Silicone stopper size “2”, pink | Cole Parmer | EW-06298-06 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20) |
| 8-Well tube Rack | VWR | 82024-452 | Culture Chamber: Order: 4 racks |
| 10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe | VWR | 89001-530 | Media: Order: 2 or more |
| Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 | Cole Parmer | EW-06298-22 | Media: Order: 2 or more |
| Carboy Venting Filter | Fisher | SLFG 050 10 | Media: Order: 1x(pack of 10) |
| Electrical tape, green | Amazon.com | 10851-BA-10 | Media: Order 1 roll. |
| Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm | VWR | 29442-978 | Media: Order: (1 case of 12) |
| 5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe | VWR | 89003-384 | Media: (Optional) |
| Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 | Cole Parmer | EW-06298-18 | Media: (Optional) |
| 205S/CA16, 16 Cartridge pump | Watson-Marlow | 020.3716.00A | Media Pump: Order: 1 |
| 16-channel 205CA Extension pump head | Watson-Marlow | 023.1401.000 | Media Pump: Order: 2 extension pump heads |
| Silicone aquarium sealer | Fisher | S18180B | Media Pump: Order: 1 |
| 6-block dry bath | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16. |
| Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16. |
| Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm | Fisher | R04SP02500 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
| Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm | Fisher | R04SP04700 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
| 47 mm, large filter apparatus | Fisher | XX10 047 30 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
| Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus | VWR | 26316-692 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
| Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen | VWR | 63380-052 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Referências
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