Ontwerp en gebruik van multiplexverzending chemostaat Arrays

De Ministat matrix hierboven en in (Figuur 1A, B) werd gebruikt om de cultuur een haploïde MATa laboratoriumstam van gist (S288c) onder sulfaat-limiterende omstandigheden zoals eerder beschreven. 10 We werkzaamheid getest gemeenschappelijke chemostaat toepassingen zoals bepaling van fysiologie en experimentele evolutie. De ministats geldig is, meermaals experimenten die zij in industriële fermentoren aangepast voor gebruik chemostaat. 10,20,21 ATR Sixfors fermentoren werden bij een 300 ml werkvolume, dan tien keer het volume van de ministats en hebben aanzienlijk verschillende modi van cultuur beluchting en agitatie. We hebben geprobeerd om apparatuur stabiliteit, steady state fysiologie, experimentele evolutie resultaten, en gen-expressie patronen verkregen met deze fermentoren repliceren. Sinds uniformiteit van verdunning en beluchting zijn belangrijke aspecten van de chemostaat ontwerp, we measured de werkelijke verdunning in 32 ministats na 15 generaties groei en dat met een doel verdunning van 0,17 vol / uur (4-5 druppels / min) we een gemiddelde verdunningssnelheid van 0,17208 bereikt met een standaarddeviatie van 0,0075 in 32 repliceert. Deze serie was in onze typische tolerantie van + / -0,01 vol / uur verschil van de doelstellingen, waarna grootschalige veranderingen in genexpressie waargenomen. Tweeëntwintig-drieëntwintig over 4 ministats het luchtdebiet werd bepaald aan 307,5 ​​ml zijn / min met een standaarddeviatie van 9,57 ml / min. Dit suggereert dat de luchtstroom in de kamers robuust is en gelijk verdeeld over de vier kamers en een waarde gelijk aan die beschreven voor beluchting in industriële fermentoren 20. We eerder waargenomen terugkerende versterking van de hoge-affiniteit zwavel-ion transporter SUL1 in 8/8 sulfaat beperkte evolutie experimenten in gist 10. Aangezien de consistentie van resultaten op this staat hebben we gekozen sulfaat-beperking van ons systeem het vermogen te testen. Een vereiste element van chemostaat cultuur is de noodzaak om een ​​constante chemische omgeving te handhaven. Schommelingen in de overvloed van een beperkende voedingsstof of andere veranderingen in de omgeving meestal resulteren in een verandering in het aantal cellen in een cultuur. We gemeten optische dichtheid als een proxy voor celaantal (Figuur 2A) en reproduceerbaarheid gemeten over 16 duplokweken het vinden van een gemiddelde van 1,12 A600 (~ 10 9 cellen) na ~ 15 generaties groei met een standaarddeviatie van 0,057 eenheden of 5,1 %. Ter vergelijking metingen van vier duplokweken gekweekt in de industriële fermentoren toonde een standaardafwijking van 2,5%. Cellen werden goed gemengd in de groeikamer: metingen van OD en cellen uit het effluent spoor waren gelijk aan monsters die rechtstreeks uit de kweekbuis (data niet getoond). Deze resultaten tonen de robuustheid van ons platform eend mogelijkheid om een ​​constante chemische omgeving te handhaven binnen een soortgelijke tolerantie als de industriële fermentor. Als gevoeliger uitlezing van fysiologie, vergeleken we genoomwijde steady state genexpressie van kweken gekweekt onder sulfaat beperking in de ministats en in de industriële fermentor. Genexpressie in de ministats toonde een hoge mate van overeenkomst over drie biologische replicaten (Figuur 2B). We hebben eerder opgemerkt dat RNA uit twee herhaalde Sixfors chemostaten en co-gehybridiseerd met een microarray expressie van genen 99% viel binnen een 1,5-voudige bereik, waardoor het gebruik van 1.5X als empirische betekenis cutoff 21. Genexpressie van drie gelijke ministats, vergeleken paarsgewijze, toonde 99% van de genen viel binnen een 1,5-1,7 maal bereik, vergelijkbaar met de resultaten van de industriële fermentoren. De drie monsters werden gehybridiseerd met individuele arrays en de paarsgewijze verhoudingen daarna berekend, zodat deze values omvatten inter-array ruis Naast biologische ruis, mogelijk overschatting van de variatie tussen repliceert in vergelijking met de gepubliceerde, co-gehybridiseerde resultaten. 138 genen differentieel tot expressie> 1,5-voudig in alle drie herhalingen Ministat vergeleken met een monster genomen van een passende kweek in de industriële fermentor. Genen daalde in uitdrukking in de ministats waren zwaar verrijkt voor ijzer metabolisme. Deze handtekening kan een afspiegeling van de verschillende metalen samenstelling van elk configuratie van het apparaat: de Sixfors inrichting omvat een metalen waaier en beluchting montage ondergedompeld in de cultuur en de media jerrycans eerder gebruikte ook vereist metalen hardware. De Ministat maakt gebruik van roestvrij stalen naalden, maar geen andere metalen onderdelen. Genen met verhoogde expressie grotendeels geassocieerd met celmembranen, maar de biologische betekenis van deze vereniging is onduidelijk. Ten slotte hebben we getest experimentele evolutie under deze voorwaarden. Na 250 generaties sulfaat beperkte groei, 4/4 klonen getest van 4 onafhankelijke populaties ontwikkeling bleek amplificatie van SUL1 zoals gedetecteerd door array comparatieve genomische hybridisatie (CGH, figuur 2C). Dit resultaat is consistent met de bevindingen in groter volume dan soortgelijke chemostaten tijdsintervallen 10. Figuur 1. A. constructie en plaatsing van de Ministat array. B. Ontwerp van de cultuur kamer. Figuur 2. A. experimental gegevens waaruit blijkt dat culturen bereiken evenwicht binnen tien generaties groei (n = 16). B. Expressie voor drie biologische duplo S1-3 bemonsterde steady state onder sulfaat beperking ten opzichte van een gemeenschappelijke referentie gekweekt in een aangepaste sulfaat beperkte Sixfors chemostaat . C. SUL1 amplificaties teruggevonden in ministats na 250 generaties van groei in een sulfaat-beperkte omgeving. Genomisch DNA uit elke kloon werd ontwikkeld vergeleken met voorouderlijke DNA door CGH beschreven. Kopienummer 21 gemiddelde werd berekend voor elke geamplificeerde gebied en naast elke amplicon zijn. Alle microarray gegevens worden afgezet in de GEO-database onder toegangsnummer GSE36691. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.