Purification des relevés de notes et de métabolites<em> Drosophila</em> Têtes
Summary
Nous décrivons ici les modalités de l'extraction et de purification de l'ARNm et de métabolites de<em> Drosophila</em> Têtes. Nous appliquons ces techniques pour mieux comprendre les perturbations cellulaires qui sous-tendent la dégénérescence neuronale. Ces méthodes peuvent être facilement mis à l'échelle et adapté à d'autres projets "omiques".
Abstract
Pendant la dernière décennie, nous avons essayé de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de la dégénérescence neuronale utilisant la drosophile comme organisme modèle. Bien que les mouches des fruits fournissent des avantages évidents expérimentales, la recherche sur les maladies neurodégénératives a surtout compté sur les techniques traditionnelles, y compris l'interaction génétique, histologie, immunofluorescence et biochimie des protéines. Ces techniques sont efficaces pour mécaniste, guidés par les hypothèses des études qui conduisent à une compréhension détaillée du rôle des gènes uniques à des problèmes bien définis biologiques. Cependant, les maladies neurodégénératives sont très complexes et touchent à plusieurs organites cellulaires et les processus au fil du temps. L'avènement des nouvelles technologies et l'âge omiques offre une occasion unique de comprendre les perturbations mondiales cellulaires sous-jacents des maladies complexes. Organismes modèles comme la drosophile flexibles sont idéales pour l'adaptation de ces nouvelles technologies en raison de leur forte annottion et de traçabilité élevé. Un défi à ces petits animaux, cependant, est la purification de molécules suffisamment d'information (ADN, ARNm, protéines, métabolites) à partir de tissus hautement pertinents, tels que les cerveaux de mouches. D'autres défis consiste à recueillir un grand nombre de mouches pour la réplique expérimentale (critique pour la robustesse statistique) et l'élaboration de procédures cohérentes pour la purification de matériaux de haute qualité biologique. Ici, nous décrivons les procédures de collecte des milliers de têtes de mouches et l'extraction des transcriptions et des métabolites de comprendre comment les changements globaux dans l'expression des gènes et le métabolisme contribuer à des maladies neurodégénératives. Ces procédures sont facilement évolutifs et peuvent être appliquées à l'étude des contributions protéomiques et épigénomiques à la maladie.
Introduction
Au siècle dernier, la drosophile s'est avérée être un outil précieux pour l'étude en laboratoire de profondes questions biologiques, notamment dans le développement, la biologie cellulaire, la génétique et de la neurobiologie 1. Les raisons de ce succès est que les mouches des fruits sont faciles à manipuler, avoir une boîte à outils en constante expansion 18, 21, 31, et possèdent un génome relativement simple de haute qualité annotation 26. Ces avantages techniques, combinées à l'ingéniosité et l'innovation constante dans la communauté volée, ont conduit à de larges contributions scientifiques, comme illustré par l'attribution de trois prix Nobel (1933, 1995, 2011). Plus récemment, la drosophile est apparue comme un modèle pertinent pour l'étude des maladies humaines, des troubles du développement, principalement l'immunité innée, le cancer et les maladies neurodégénératives 2. Nous sommes particulièrement intéressés à découvrir les bases cellulaires et moléculaires des maladies neurodégénératives. Ces co complexe et diversifiénditions sont liés à des assemblées, des oligomères solubles, peut-être des protéines anormalement repliées et sont, par conséquent, facilement modelable de mouches. Toutes les grandes maladies neurodégénératives, y compris la maladie d'Alzheimer, de Parkinson et la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique, les ataxies plusieurs tauopathies, les maladies à prions, et d'autres maladies rares, ont été modélisés de mouches dans les quinze dernières années 23. Fly laboratoires ont contribué à la compréhension de ces maladies principalement en exploitant les prouesses de génétique de la Drosophile à identifier de nouveaux gènes impliqués dans la neurotoxicité des protéines pathogènes. Une fois que de nouveaux gènes pertinents pour la cascade neurotoxique sont identifiés, leurs effets sont généralement analysés par les méthodes traditionnelles, y compris histologie pour déterminer les modèles de dégénérescence, immunofluorescence pour déterminer la distribution des protéines et la pathologie cellulaire, et des analyses biochimiques pour évaluer la quantité et le type de conformations de protéines anormales . Enfin, comportementanalyse ioral sert une lecture fonctionnelle de résultats sanitaires. Ces techniques bien établies ont été exploitées pour examiner la contribution d'un ou de quelques gènes candidats à l'évolution de la maladie, y compris le stress oxydatif mitochondrial et la dysfonction 13, dérégulation transcriptionnelle 9, 27, 30, aberrante transport axonal et l'activité synaptique 14, anormale ARN biologie 9, cellulaire dérégulée de signalisation 29, dyshomeostasis ER 6, entravé protéostasie cellulaire 33, et bien d'autres 23. Toutefois, il n'est pas clair comment ces protéines toxiques peuvent perturber simultanément avec de multiples voies interconnectés, ce qui est la séquence temporelle de ces modifications, et quelle est la contribution relative de chaque voie à la pathogenèse. Des décennies de recherches ont porté sur un seul gène, guidés par les hypothèses des approches à la fois les humains et les modèles animaux ont conduit à une incomplet, curieux des mécanismes cellulaires qui provoquentneurodégénérescence. La compréhension actuelle mal les mécanismes exacts par lesquels ces assemblages protéiques toxiques causent neuropathologie est une contrainte majeure pour le développement de thérapies modifiant la maladie.
Nous sommes maintenant intéressés à l'application de nouvelles approches pour comprendre comment ces protéines pathogènes induisent des perturbations cellulaires mondiaux. L'avènement de l'ère omics permet la profondeur de sondage de complexes problèmes biologiques en utilisant sophistiquées technologies à haut débit, ce qui peut conduire à des traitements efficaces contre ces maladies dans un avenir proche. D'expression des gènes (transcriptome) des études ont été établies à l'issue de séquences génomiques multiples depuis de haute qualité annotation ne peut prédire la plupart des transcriptions. L'application récente de séquençage de nouvelle génération pour l'analyse transcription (ARN-seq) a fourni de nouveaux avantages et opportunités par rapport aux puces, y compris une approche impartiale, l'amélioration quantitative gamme, et un coût réduit 32.Nous voulons exploiter les avantages de l'ARN suivants afin de mieux comprendre la forme la plus commune de transmission dominante ataxie, l'ataxie spinocérébelleuse de type 3 (SCA3) ou maladie de Machado-Joseph. SCA3 est un monogénique, maladie dominante avec pénétrance complète, causé par une expansion CAG dans le gène trinucléotide Ataxin3 (ATXN3) 16. Cette mutation conduit à la production de la protéine avec un Atxn3 polyglutamine (polyQ) longue piste qui rend vulnérable aux granulats. Depuis mutant Atxn3 est l'agent neurotoxique dans SCA3 responsable de toutes les perturbations liées à la maladie, c'est une maladie idéal pour l'application de ces nouvelles approches omiques. En outre, SCA3 était l'une des premières maladies neurodégénératives modélisés dans les mouches 34.
Tout en mettant en place des procédures de collecte un grand nombre de têtes de mouches pour l'ARN-seq, nous avons réalisé que nous pourrions utiliser le même matériau pour la réalisation d'études globales d'autres molécules informationnelles. Parmi les autres discip émergentslignes, la protéomique, la métabolomique épigénomique, et permettre l'examen de la pathologie cellulaire à une profondeur pas encore atteint, mais non sans difficultés. Par opposition à l'ARNm, le catalogue de protéines et de métabolites est assez incomplète en ce moment en raison de la difficulté accrue à prévoir toutes les variantes possibles d'épissage et de l'origine encore plus énigmatique de toutes les métabolites normaux et pathogènes. De gros efforts sont en cours pour cataloguer protéines dans de nombreux organismes et dans des conditions pathologiques. Pour cela, nous avons voulu mettre l'accent sur la contribution des métabolites dégradés de SCA3 pathogenèse en utilisant un organisme simple comme la drosophile. Il s'agit d'un domaine relativement nouveau et prometteur, en particulier avec l'introduction récente de la résonance magnétique nucléaire (RMN), qui fournit une haute reproductibilité et ne détruit pas les 5 échantillons, 24. Nous proposons que le profilage métabolite peut contribuer à identifier les biomarqueurs et les mécanismes impliqués dans les maladies neurodegeneratisur.
Une considération importante à ces projets omiques est qu'elles nécessitent de grands échantillons uniformes (200 têtes volantes) ainsi que des techniques de purification précis pour minimiser les variations expérimentales. Nous avons commencé à recueillir des mouches en suivant les procédures que nous avions précédemment utilisées pour les puces et également utilisé récemment pour l'ARN-seq 12. Mais nous avons vite rencontré un certain nombre de problèmes liés à misexpressing les SCA3 constructions. Tout d'abord, nous avons dû choisir un pilote Gal4 pour ces 4 expériences, où le tissu cible pour l'analyse était le cerveau. Le choix évident serait un pilote pan-neurones depuis SCA3 est une maladie du cerveau. Toutefois, étant donné que nous avons l'intention de recueillir des ARNm et des métabolites de têtes entières, cette option produire du matériel mixte de tissus exprimant ou non l'expression des constructions. Pour générer des échantillons homogènes où toutes les cellules expriment les constructions, nous avons décidé d'utiliser un driver de ligne faible mais omniprésent, orpheline (da)-Gal4. Interespicotement, de nombreux gènes impliqués dans des maladies neurodégénératives, y compris ATXN3 20, ont une large distribution, ce qui rend le choix de l'expression ubiquitaire approprié. Ensuite, nous avons rencontré un autre problème: l'expression ubiquitaire de pathogènes Atxn3-78Q causé létalité au cours du développement. Pour contourner cette létalité, nous avons intégré GAL80 ts pour contrôler l'activation de Gal4 temporelle 19. Cela nous a permis de recueillir les mouches expérimentales, l'âge eux pour un maximum de 20 jours, les congeler et traiter leurs têtes lyophilisés pour les deux ARN (TRIzol) ou les métabolites (méthanol-chloroforme) extraction (figure 1). Nous avons déjà utilisé ce protocole pour obtenir des échantillons pour les analyses transcriptomiques et métabolomiques, mais il existe d'autres applications évidentes de cette technique (par exemple, la protéomique ou neuro-peptidomic analyses).
Aperçu expérimentale: L'objectif global de ces protocoles est de soutenir la collecte de consiéchantillons de stent de têtes de mouches pour l'extraction des transcriptions et des métabolites. L'objectif spécifique de ces procédures est d'acquérir des mouches exprimant Atxn3-27Q et 78Q-Atxn3 (non pathogènes et pathogènes constructions expérimentales) ainsi que LacZ (contrôle de construction), où un seul échantillon est composé de 200 têtes de mouches. Bien que la technologie actuelle permet l'analyse de très petits échantillons, y compris des cellules individuelles 28, nous avons regroupé 200 chefs d'éliminer une variation expérimentale, biologiques et techniques, ce qui nous permet d'identifier les changements cellulaires associés au processus de la maladie avec une confiance statistique élevé. Cette approche est conçue pour détecter uniquement les modifications de l'expression des gènes qui sont conformes à la population, nous diriger vers les voies les plus critiques conduite dégénérescence. Comme nous nous intéressons à l'âge dépendant des changements dans les têtes de ces mouches, chaque génotype a été obtenue à 1, 10, et 20 jours d'âge.
Un aspect fondamental de cesanalyses globales est la production de réplicats biologiques qui soutiennent une analyse statistique robuste. Notre expérience précédente avec des microréseaux et RNA-Seq suggère que l'analyse d'échantillons biologiques en trois exemplaires, offrant une forte signification statistique des données 11, 12. Nous décrivons dans la section 1) comment générer une réplique biologique unique (Rep 1) pour chaque point de génotype et de l'heure. Ces procédures peuvent être répétées pour générer Reps 2 et 3, ou fait en parallèle, à condition que chaque représentant est correctement identifié. Bien que trois Représentants est le but, la fixation d'un quatrième (voire cinquième) Rep est fortement recommandé de couvrir les questions liées à la faible rendement, perte de mouches au cours du vieillissement, ou la perte accidentelle de matériel (mouches, des têtes ou ARN) dans un ou plusieurs échantillons.
Nous avons trouvé que dix croix (bouteilles identifiées par des lettres AJ) une progéniture suffisante pour obtenir 200 têtes / génotype / heure du point. Un soin extrême doit être appliquée pour éviter toute confusion, car un grand nombre de bouteilles d'unre nécessaire pour obtenir une Rep (10 bouteilles x 3 x 3 génotypes points dans le temps = 90 bouteilles). Pour cela, nous avons désigné chaque bouteille à l'aide du génotype, point de temps, et la lettre de la bouteille. Par exemple, SCA3-27Q 20E se réfère à la cinquième bouteille (dix) des mouches exprimant Atxn3-27Q vieilli pendant 20 jours. Une fois la descendance Eclose, les mouches sont maintenus dans des flacons séparés marqués à l'identifiant unique.
Nous avons maintenu le nombre de mouches obtenus pour chaque échantillon, bouteille, et un point de collecte (matin et soir) dans une feuille de calcul Excel. Nous avons révisé le nombre de mouches par flacon avant de congeler afin de tenir compte de la létalité et évadés. À partir de ces chiffres définitifs, les flacons en ajoutant 200 mouches peut être facilement localisé avant d'ouvrir le congélateur, contribuant ainsi à la conservation des échantillons. Puisque les mouches recueillies à partir d'une bouteille ne peut être utilisé dans une Rep, nous avons maximisé leur contribution par répétition biologique, bien que tous les Reps contenues mouches de plusieurs bouteilles. Nous avons réservéles mouches de bouteilles non utilisées dans leur Rep prévue pour les représentants d'autres, comme des échantillons de remplacement, ou pour d'autres expériences connexes (western blot, qPCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Forts de notre expérience dans la transcriptomique 11, 12, métabolisme 15, et les maladies neurodégénératives 6, 8, nous présentons ici un nouveau protocole pour la collecte de milliers de têtes de mouches adultes avec une expression spécifique des gènes pathogènes, et l'ARNm purifier et de ses métabolites pour l'ARN- suivants et spectroscopie RMN, respectivement. La nature de ces expériences nécessaire l'intégration de plusieurs innovations avant la collecte mouche, y compris la sélection d'une ligne omniprésente Gal4 et l'utilisation de la régulation temporelle de l'expression des gènes. En ce qui concerne Gal4, expression ubiquitaire des transgènes a été cruciale pour deux raisons. Tout d'abord, un grand nombre de gènes impliqués dans les maladies neurodégénératives, y compris ATXN3, la huntingtine, la protéine précurseur amyloïde, et superoxyde dismutase 1, entre autres, sont largement exprimés dans les cellules neuronales et gliales ainsi que dans d'autres types cellulaires en dehors du système nerveux. Nous voulionsmodéliser correctement cet aspect de la biologie de ces gènes pathogènes en analysant les conséquences de l'expression omniprésente plutôt que de se concentrer uniquement sur l'expression de neurones. Deuxièmement, il n'est pas possible de recueillir des cerveaux de mouches en grand nombre, mais nous pouvons le faire avec des têtes de mouches (plus de 200 en trois exemplaires, par condition) 11, 12. Homogénéisation de têtes depuis entiers mélanges tissus nerveux et non neuronal, l'expression du transgène ubiquitaire devient critique pour l'obtention d'ARN uniformes et des métabolites à partir de populations de cellules exprimant les transgènes mêmes. Il est important de noter que da-Gal4 a été choisi pour sa distribution relativement homogène, pas à cause de son niveau d'expression élevé, même si une étude récente suggère que da-Gal4 peut-être pas totalement omniprésent 25. Nous avions déjà envisagé d'autres omniprésents Gal4 lignes, y compris les bras, baignoire-et-Loi Ga4, mais ils ont tous montré des profils d'expression complexes dans le SNC adulte et les muscles, ce qui les rend moins undequate pour cette étude. En fait, l'immunofluorescence dans le cerveau adulte a montré que da-Gal4 induit l'expression répandue, mais faible, qui ne accumulées à des niveaux élevés dans les centres cérébraux constitués de quelques milliers d'axones et dans quelques neurones de grande taille (figure 2). Bien que les niveaux d'expression des constructions étaient faibles, ces conditions réduit considérablement la survie d'une manière polyQ-dépendante. Cette dynamique d'expression répondu à nos besoins tout en gardant une faible expression, ce qui était important pour l'observation des lentes, progressives des altérations cellulaires induites par des protéines neurotoxiques.
Une conséquence prévisible d'induire l'expression ubiquitaire de protéines neurotoxiques, c'est qu'il a causé létalité avant l'éclosion des adultes. Heureusement, cette complication fut contournée par l'utilisation de GAL80 ts. Comme indiqué plus haut, l'expression du gène atteint des niveaux maximaux d'environ 48 h après le changement de température, ce qui cadre bien avec le temps frame de l'expérience. Un avantage supplémentaire de l'utilisation GAL80 ts, c'est que, contrairement aux expériences où les protéines neurotoxiques sont exprimées de manière constitutive pan-neurale, il n'y avait pas d'expression au cours du développement du système nerveux. Ainsi, l'utilisation de GAL80 ts créé un "propre" arrière-plan où le système nerveux n'a pas été exposé aux activités toxiques de ces protéines neurotoxiques au cours de stades sensibles du développement. À notre avis, l'activation de l'expression des gènes chez les adultes conduit à un meilleur modèle pour cette catégorie de pathologies de l'adulte. Cependant, GAL80 ts a également présenté quelques complications associées aux changements de température. La première est que les mouches croissance à basse température (18-20 ° C) ont retardé le cycle de vie, ce qui rend les expériences significativement plus longue. En outre, il est bien connu que les mouches croissance à des températures élevées (29-31 ° C) accélère leur métabolisme, comme l'illustre la durée de vie raccourcie par rapport aux mouches âgés de moins 25 ° C. Since les études de la transcription et métabolique sera effectué dans les mouches âgées à haute température, on peut s'attendre à voir des changements importants dans les voies de stress cellulaire et le métabolisme énergétique. C'est pourquoi il est si important d'introduire deux contrôles à l'expérience, l'un avec le non-pathogène Atnx3-27Q et un contrôle sans rapport exprimant LacZ. Ces contrôles fournissent une base pour l'expression des gènes et des changements métaboliques associés à température élevée afin que nous puissions identifier les changements directement liés à l'expression de Atxn3 toxiques. Dans l'ensemble, nous avons introduit plusieurs modifications à la collection de mouches qui offrent de nombreux avantages – et quelques inconvénients (problèmes de température et le paragraphe suivant) – pour l'étude de l'adulte, des maladies évolutives.
Bien que la régulation temporelle avec GAL80 ts est un ajout utile, il a également introduit une complication inattendue. Alors que la génération des mouches portant à la fois un GAL80 tsnd da-Gal4 constructions dans un stock stable, nous avons remarqué que vole doublement homozygotes pour les deux constructions étaient viables mais stériles. Depuis homozygote GAL80 ts et da-Gal4 souches étaient viables et fertiles par eux-mêmes, il n'est pas clair pourquoi la combinaison affiché une faible fécondité. On sait depuis un certain temps que Gal4 est légèrement toxique pour les tissus Drosophila 22. Il est donc possible que l'expression hétérologue de la levure GAL80 répresseur transcriptionnel contribué à la toxicité de Gal4 en interférant, potentiellement, avec la machinerie transcriptionnelle endogène. Cette toxicité peut être aggravé par la distribution ubiquitaire de Gal4 sous le contrôle de da, un gène qui joue un rôle clé dans le développement précoce et la détermination sexuelle. Quelles que soient les causes sous-jacentes de la stérilité, nous avons élargi le ts GAL80; da-Gal4 mouches par le maintien d'un chromosome d'équilibrage sur da-Gal4 tout en gardant le homozygosity pour GAL80 t s, ce qui suggère que Gal4 est un contributeur plus important pour la stérilité. Cette solution a été la clé parce que nous avons utilisé des centaines de ces hommes toutes les deux semaines pour traverser avec chacun des transgènes UAS. Toutefois, la réalisation d'une traverse d'équilibrage de travail supplémentaire créée lors de la sélection de la descendance appropriée. Seul un quart (25%) de la descendance ont été recueillis (les femelles, non-équilibrage), qui a ajouté le temps de sélection, réduit le rendement par bouteille, et a augmenté le nombre de bouteilles nécessaires à l'obtention d'au moins 200 mouches par génotype / reproduire / heure point. Dans l'ensemble, bien que la collecte de mouches est devenu beaucoup de temps à cause des grands ensembles nécessaires, nous sommes convaincus que l'étude des changements cellulaires quelques heures seulement après avoir allumé l'expression des gènes pathogènes ubiquitaire permettra d'identifier de nouveaux procédés et intéressant impliqués dans la perte neuronale progressive.
Une fois que la conception génétique est en place, nous avons accordé une attention particulière à lamanipulations expérimentales qui pourraient introduire une variabilité biologique. Tout d'abord, nous avons seulement recueilli des femelles vierges afin d'assurer l'homogénéité des échantillons, même si cela signifiait jeter les mâles et la vérification de la descendance deux fois par jour. Au cours du vieillissement, pas plus de 12 mouches ont été maintenus dans le même flacon pour éviter la surpopulation et le stress. Aussi, avant de les congeler, les mouches ont été transférés à cryotubes sans anesthésie et ont pu récupérer du transfert pendant 30 min. Ces facteurs apparemment insignifiants peuvent influer sur l'expression des gènes et le métabolisme, l'introduction de la variabilité dans l'analyse finale qui ne serait pas pertinente à l'expérience.
Pour garantir la qualité des matériaux gelés (têtes, l'ARN et les métabolites), nous avons accordé une attention particulière à chaque détail qui peut contribuer à la dégradation des tissus. Puisque les mouches sont transférés à cryotubes en petit nombre (jusqu'à 12 mouches par flacon), nous avons dû récupérer des flacons de nombreux pour la collecte de 200 têtes. Ces manipulations ont été dune avec un soin extrême dans une chambre froide avec de la glace carbonique et azote liquide. La collection de mouches, la séparation des têtes, et la purification de molécules d'information prend trop de temps pour découvrir que le matériel a été dégradé à la fin de ce long processus. En plus de veiller à ce que le matériau conserve sa qualité, ce protocole décrit plusieurs mesures qui maximisent le rendement de l'ARN et des métabolites, y compris la lyophilisation et les coups de talon. Ces étapes ne sont pas nécessaires pour les extractions normal pour la RT-PCR ou PCR quantitative des mouches entiers, mais ils sont essentiels pour la purification constante à partir d'échantillons de petite taille tels que les têtes de mouches. Nous avons déterminé que d'autres mesures affectent le rendement de l'ARN. Par exemple, les personnes âgées mouches produites ARN nettement moins que les jeunes mouches, quel que soit le génotype. Cette observation suggère que le vieillissement à haute température provoque des changements dramatiques. En outre, l'extraction d'ARN à partir de 100 chefs était en fait plus efficace que de 200 têtes, donc nous avons procédé à purifier dans deux batches de 100 par échantillon, pour les combiner après vérification de la qualité avec le BioAnalyzer. En outre, les colonnes de purification d'ARNm semblait saturer facilement, de sorte que la quantité d'ARN total utilisé par colonne doit être optimisé.
Les métabolites sont un mélange diversifié de petites molécules, donc le contrôle de qualité est plus difficile que l'ADN, l'ARN ou les protéines. Malheureusement, il n'existe pas de catalogue complet de métabolites pour tout modèle animal à ce moment, quelque chose qui pourrait changer dans les prochaines années grâce à quelques l'application de plusieurs innovations technologiques, y compris la spectroscopie RMN et l'utilisation accrue de la chromatographie liquide – spectrométrie de masse ( LC-MS). Bien que la RMN est moins sensible que la SP, il présente de nombreux avantages prometteurs, notamment l'absence de destruction des échantillons, aucune procédure d'analyse qui introduisent des biais (LC), et une reproductibilité élevée qui permet la comparaison statistique des Représentants et plusieurs conditions expérimentales 24. Ainsi, l'échantillon peut êtreun nouveau test afin de vérifier les observations ou ré-analysés par LC-MS pour valider les données de RMN. Ici, nous avons montré données RMN préliminaires de mouches que nous utilisons pour compiler un catalogue de métabolites chez la drosophile. Cette information sera essentielle pour déterminer comment l'expression des gènes pathogènes modifie le métabolisme normal, l'ouverture d'une nouvelle fenêtre pour faire avancer la compréhension des mécanismes cellulaires qui sous-tendent les maladies neurodégénératives.
Émergentes technologies omiques offrent la meilleure opportunité pour étudier les maladies neurodégénératives à un niveau de détail n'est pas atteint auparavant. Peut-être le plus grand obstacle à surmonter dans ces études à haut débit est la collecte d'échantillons fidèle reproductibles qui peuvent être analysés avec des méthodes très sensibles. Les procédures mises en place ici fournissent un moyen de parvenir à cette cohérence, et conduira à des résultats qui peuvent être facilement comparés entre les ensembles de données. Bien que nos principaux intérêts de recherche impliqué des changements examen de gène expresseions et des métabolites, les mouches générés pourraient également être soumises à une analyse protéomique ou épigénomique. Modifications protéomiques et épigénomiques survenant pendant la neurodégénérescence sont également susceptibles d'être d'une importance primordiale pour le processus de la maladie. Lorsque la communauté scientifique identifie finalement le spectre complet des changements moléculaires impact sur le processus de la maladie, une compréhension véritable niveau des systèmes de la maladie sera possible. A ce niveau, les thérapies modifiant la maladie finira par s'imposer comme une réalité.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Janice Santiago, Gabriel Figueroa et José Herrera pour l'assistance technique et la drosophile Bloomington Stock Center à l'Université d'Indiana pour les stocks à la mouche. DH et CW ont été soutenus par des fonds de la NSF-IOS-1051890. PF-F et LMM ont été pris en charge par un fonds de stimulation de chances de l'Université de Floride.
Materials
| Reagent | Company | Cat. Number | Comments |
| Jazz mix Drosophila food | Fisher Scientific | AS-153 | |
| Cryogenic Vials | Corning, Inc. | 430658 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-175-C-S | |
| RNaseZap | Ambion | AM9786 | Treat all surfaces |
| 5/32″ grinding balls, stainless steel | OPS Diagnostics | GSS 156-5000-01 | |
| TRIzol | Ambion | 15596018 | |
| 1-bromo-3-chloropropane | Sigma | B9673-200ML | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| DEPC-treated water | Fisher Scientific | BP561-1 | |
| DNase I | Promega | M6101 | |
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification kit | Invitrogen | 610-06 | |
| Conical Screw Cap Tubes | Fisher Scientific | 02-681-344 | |
| Screw Caps w/O-Rings | Fisher Scientific | 02-681-364 | |
| 2.0 mm Zirconia beads | BioSpec Products | 11079124zx | |
| Methanol, HPLC-grade | Fisher Scientific | A4524 | |
| Chloroform, HPLC-grade | Acros organics | AC39076 | |
| Drosophila Stocks | |||
| da-Gal4 | Bloomington Stock Center | 5460 | |
| Gal80[ts] | Bloomington Stock Center | 7108 | |
| UAS-MJD-27Q | Bloomington Stock Center | 8149 | |
| UAS-MJD-78Q | Bloomington Stock Center | 8150 | |
| UAS-LacZ | Bloomington Stock Center | 8529 | |
| Equipment | |||
| Inject+Matic Sleeper | INJECT+MATIC | ||
| Microsieve Set | Fisher Scientific | 3410531 | Use two largest meshes |
| Geno/Grinder 2000 | SPEX Sample Prep | SP2100-115 | |
| Sorvall Legend Microcentrifuge | ThermoScientific | 75002436 | |
| FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System | LabConco | 7670041 | |
| BioAnalyzer v. 2.6 | Agilent | 2100 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Fast Prep bead-beater | ThermoScientific | FP120 | |
| Centrivap Vacufuge Plus | Labconco | 022820001 |
Referências
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