Zuivering van Afschriften en metabolieten van<em> Drosophila</em> Hoofden
Summary
We beschrijven hier de procedures voor de extractie en zuivering van mRNA en metabolieten uit<em> Drosophila</em> Hoofden. We zijn het toepassen van deze technieken om beter inzicht in de cellulaire verstoringen ten grondslag liggen aan de neuronale degeneratie. Deze methoden kunnen eenvoudig worden geschaald en aangepast voor andere "nomische" projecten.
Abstract
Voor de laatste tien jaar hebben we geprobeerd om de moleculaire en cellulaire mechanismen van neuronale degeneratie met behulp van Drosophila als modelorganisme te begrijpen. Hoewel fruitvliegen te bieden voor de hand liggende experimentele voordelen, heeft het onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten vooral vertrouwd op de traditionele technieken, met inbegrip van genetische interactie, histologie, immunofluorescentie en eiwit biochemie. Deze technieken zijn effectief voor mechanistische, hypothese-gedreven studies, die leiden tot een gedetailleerd inzicht in de rol van de afzonderlijke genen in welbepaalde biologische problemen. Echter, neurodegeneratieve ziekten zijn zeer complex en beïnvloeden meervoudige cellulaire organellen en processen tijd. De komst van nieuwe technologieën en de omics leeftijd biedt een unieke kans om de mondiale cellulaire verstoringen ten grondslag ligt aan complexe ziekten te begrijpen. Flexibele modelorganismen zoals Drosophila zijn ideaal voor de aanpassing van deze nieuwe technologieën vanwege hun sterke annotatie en hoge handelbaarheid. Een probleem met deze kleine dieren is echter de zuivering van voldoende informatie moleculen (DNA, mRNA, eiwit, metabolieten) uit zeer relevante weefsels zoals hersenen fly. Andere uitdagingen zijn verzamelen grote aantallen vliegen voor experimentele duplo (belangrijk voor statistische robuustheid) en de uitwerking van samenhangende procedures voor de zuivering van hoogwaardige biologisch materiaal. Hier beschrijven we de procedures voor het verzamelen duizenden fly kop en de winning van transcripten en metabolieten te begrijpen hoe globale veranderingen in genexpressie en metabolisme bijdragen aan neurodegeneratieve ziekten. Deze procedures zijn gemakkelijk schaalbaar en kan worden toegepast op de studie van proteomische en epigenomisch bijdragen ziekte.
Introduction
In de vorige eeuw, is Drosophila bewezen van onschatbare waarde laboratorium instrument voor het onderzoeken van diepgaande biologische vragen, met name in de ontwikkeling, celbiologie, genetica, en neurobiologie 1 zijn. De redenen voor dit succes is dat fruitvliegen zijn makkelijk te manipuleren, hebben een steeds groeiende gereedschapskist 18, 21, 31, en beschikken over een relatief eenvoudige genoom met hoogwaardige annotatie 26. Deze technische voordelen, in combinatie met vindingrijkheid en voortdurende innovatie binnen de vlieg gemeenschap, hebben geleid tot een brede wetenschappelijke bijdragen, zoals wordt geïllustreerd door de toekenning van drie Nobelprijzen (1933, 1995, 2011). Meer recentelijk is gebleken Drosophila als relevant model voor het bestuderen van menselijke ziekten, vooral ontwikkelingsstoornissen, aangeboren immuniteit, kanker en neurodegeneratie 2. Wij zijn vooral geïnteresseerd in het blootleggen van de cellulaire en moleculaire basis van neurodegeneratieve ziekten. Deze complexe en diverse conditions zijn gekoppeld aan samenstellingen eventueel oplosbare oligomeren van abnormaal gevouwen eiwitten en derhalve gemakkelijk gemodelleerd in vliegen. Alle belangrijke neurodegeneratieve ziekten, zoals Alzheimer, Parkinson en Huntington's ziekte, amyotrofe laterale sclerose, verschillende ataxias, tauopathieën, prion ziekten en andere zeldzame aandoeningen, zijn gemodelleerd in vliegen in de laatste vijftien jaar 23. Fly laboratoria hebben bijgedragen aan het begrijpen van deze ziekten voornamelijk door het benutten van de dapperheid van Drosophila genetica om nieuwe genen die betrokken zijn bij de neurotoxiciteit van de pathogene eiwitten te identificeren. Zodra nieuwe genen die relevant zijn voor de neurotoxische cascade worden geïdentificeerd, worden hun effecten meestal geanalyseerd door traditionele benaderingen, met inbegrip van histologie na te gaan patronen van degeneratie, immunofluorescentie aan eiwit distributie en cellulaire pathologie vast te stellen, en biochemische analyses van de hoeveelheid en het type van abnormale eiwitten conformaties te beoordelen . Tenslotte gedragioral analyse dient als een functionele uitlezing van de ziekte uitkomsten. Deze gevestigde technieken benut om de bijdrage van een of enkele kandidaatgenen onderzocht het ziekteproces, inclusief oxidatieve stress en mitochondriale disfunctie 13 transcriptionele ontregeling 9, 27, 30, afwijkende axonale transport en synaptische activiteit 14, abnormale RNA biologie 9, ontregelde cell signaling 29 ER dyshomeostasis 6, gehinderde cellulaire proteostasis 33, en vele anderen 23. Het is echter niet duidelijk is hoe deze giftige eiwitten tegelijk kunnen interfereren met meerdere onderling verbonden paden, wat is de chronologische volgorde van deze wijzigingen, en wat is de relatieve bijdrage van elke pad naar pathogenese. Tientallen jaren van onderzoek gericht op enkel gen, zijn hypothese-gedreven benaderingen bij mensen en diermodellen leidde tot een onvolledige raadselachtige beeld van de cellulaire mechanismen die leidenneurodegeneratie. De huidige weinig inzicht in de exacte mechanismen waarmee deze samenstellingen veroorzaken toxische eiwit neuropathologie is een belangrijke beperking voor de ontwikkeling van ziekte-modificerende behandelingen.
We zijn nu geïnteresseerd in de toepassing van nieuwe benaderingen voor het begrip hoe deze pathogene eiwitten wereldwijde cellulaire verstoringen veroorzaken. De komst van de omics tijdperk maakt het mogelijk de diepe indringende van complexe biologische problemen met behulp van geavanceerde high-throughput technologieën, die kunnen resulteren in effectieve ziekte behandelingen in de nabije toekomst. Genexpressie (transcriptomics) studies werden ingesteld naar aanleiding van de voltooiing van meerdere genoomsequenties sinds hoogwaardige annotatie kunnen de meeste transcripties voorspellen. De recente toepassing van next-generation sequencing om transcript analyse (RNA-seq) heeft nieuwe voordelen en kansen in vergelijking met microarrays, met inbegrip van een onbevooroordeelde benadering, verbeterde kwantitatieve bereik en lagere kosten 32.We willen de voordelen van RNA-seq benutten om beter inzicht in de meest voorkomende vorm van dominant erfelijke ataxie, spinocerebellaire ataxie type 3 (SCA3) of Machado-Joseph ziekte. SCA3 een monogene, dominante ziekte vol penetrantie, veroorzaakt door een CAG trinucleotide expansie in de Ataxin3 gen (ATXN3) 16. Deze mutatie leidt tot de productie van Atxn3 eiwit met een lange polyglutamine (polyQ) track waarmee gevoelig te aggregeren. Het mutante Atxn3 de neurotoxische agent in SCA3 verantwoordelijk voor alle ziekte-gerelateerde storingen is dit een ideaal ziekte toepassing van deze nieuwe nomische benaderingen. Bovendien SCA3 was een van de eerste neurodegeneratieve ziekten gemodelleerd vliegen 34.
Terwijl de invoering van de procedures voor het verzamelen van grote aantallen vliegen hoofden voor RNA-seq, realiseerden we ons dat we konden hetzelfde materiaal te gebruiken voor het uitvoeren van wereldwijde studies van andere informatieve moleculen. Onder andere opkomende disciplijnen, proteomics, Epigenomics, en metabolomics toe het onderzoek van de cellulaire pathologie op een diepte die niet eerder bereikt, hoewel niet zonder uitdagingen. In tegenstelling tot mRNA, de catalogus van eiwitten en metabolieten vrij onvolledig op dit moment vanwege de toegenomen moeilijkheid in het voorspellen van alle mogelijke splicing varianten en de nog raadselachtige oorsprong van alle normale en pathogene metabolieten. Grote inspanningen zijn momenteel aan eiwitten catalogus in vele organismen en ziekten. Hiervoor wilden we focussen op de bijdrage van veranderde metabolieten te SCA3 pathogenese behulp van een eenvoudige organisme, zoals Drosophila. Dit is een relatief nieuwe en veelbelovende gebied, met name met de recente introductie van nucleaire magnetische resonantie (NMR), die hoge reproduceerbaarheid en voorziet niet vernietigen van de monsters 5, 24. Wij stellen voor dat metaboliet profilering kan bijdragen aan het identificeren van biomarkers en ziektemechanismen betrokken bij neurodegeneratiop.
Een belangrijke overweging bij deze nomische projecten is dat zij vereisen grote uniforme monsters (200 fly koppen) en zuiveringstechnieken nauwkeurige experimentele variatie te minimaliseren. We zijn begonnen met vliegen te verzamelen volgens de procedures die we eerder hadden gebruikt voor microarrays en onlangs ook gebruikt voor RNA-seq 12. Maar al snel geconfronteerd met een aantal problemen met betrekking tot misexpressing de SCA3 constructen. Eerst moesten we een Gal4 stuurprogramma te selecteren voor deze experimenten 4, waar het te onderzoeken weefsel voor analyse was de hersenen. De voor de hand liggende keuze zou een pan-neurale bestuurder zijn, aangezien SCA3 is een ziekte van de hersenen. Echter, aangezien we van plan om mRNA en metabolieten uit hele kroppen te verzamelen, zou deze optie gemengde materiaal produceren van weefsels die als niet-uiting van de constructen. Om homogene monsters waar alle cellen brengen de constructen te genereren, hebben we besloten om een zwakke, maar alomtegenwoordige coureurs, daughterless (da)-Gal4 gebruiken. Interestingly, meerdere genen betrokken bij neurodegeneratieve ziekten, waaronder ATXN3 20, een brede verdeling, waardoor de keuze van alomtegenwoordige expressie geschikt. Daarna kwamen we een tweede probleem: universele expressie van pathogene Atxn3-78Q veroorzaakt letaliteit tijdens de ontwikkeling. Om dit te omzeilen dodelijkheid, we opgenomen Gal80 ts naar de tijdelijke activering van Gal4 19 te controleren. Dit liet ons toe om de experimentele vliegen, de leeftijd te verzamelen voor maximaal 20 dagen, te bevriezen, en hun gevriesdroogd hoofd te verwerken voor een van beide RNA (TRIzol) of metaboliet (methanol-chloroform) extractie (Figuur 1). We hebben al gebruik gemaakt van deze protocol voor het verkrijgen van monsters voor transcriptoom-en metabolomics analyse, maar er zijn andere voor de hand liggende toepassingen voor deze techniek (bijvoorbeeld proteomics of neuro-peptidomic analyses).
Experimentele overzicht: De algemene doelstelling van deze protocollen is de ondersteuning van het verzamelen van Consistent monsters van vliegen hoofden voor de extractie van transcripties en metabolieten. Het specifieke doel van deze procedures is het verkrijgen vliegen expressie Atxn3-27Q en 78Q Atxn3-(niet-pathogene en pathogene experimentele constructen) en LacZ (controle construct), wanneer een enkel monster bestaat uit 200 fly koppen. Hoewel de huidige technologie maakt het mogelijk de analyse van zeer kleine monsters, met inbegrip van enkele cellen 28, we gebundeld 200 hoofden tot experimentele, biologische en technische variatie te elimineren, waardoor we de cellulaire veranderingen die gepaard gaan met de ziekte proces met een hoge statistische betrouwbaarheid te identificeren. Deze aanpak is bedoeld om alleen die veranderingen in genexpressie die consistent zijn in de bevolking, om ons in de richting van de meest kritieke paden rijden degeneratie te detecteren. Omdat we geïnteresseerd zijn in leeftijdsafhankelijke veranderingen in de hoofden van deze vliegen, werd elk genotype verkregen bij 1, 10, en 20 dagen oud.
Een fundamenteel aspect van dezeglobale analyses is de productie van biologische replica die ondersteuning een robuuste statistische analyse. Onze eerdere ervaringen met microarrays en RNA-seq suggereert dat analyse van biologische monsters in drievoud zijn sterke statistische significantie van de data 11, 12. We beschrijven in hoofdstuk 1) hoe je een enkele biologische herhaling (Rep 1) voor elk genotype en het tijdstip te genereren. Deze procedures kunnen worden herhaald om Reps 2 en 3 genereert, of parallel uitgevoerd, zolang elke Rep goed geïdentificeerd. Hoewel drie Reps is het doel, het instellen van een vierde (of zelfs vijfde) Rep is sterk aanbevolen om kwesties in verband met lage opbrengst, verlies van vliegen tijdens het ouder worden, of onbedoeld verlies van materiaal (vliegen, hoofden, of RNA) te dekken in een of meer monsters.
We vonden dat tien kruisen (flessen aangeduid door letters AJ) voldoende nakomelingen tot 200 koppen / genotype / tijdstip te verkrijgen geproduceerd. Men moet uiterst voorzichtig worden toegepast om verwarring te voorkomen, omdat een groot aantal flessen peropnieuw nodig is om een Rep (10 flessen x 3 genotypen x 3 tijdstippen = 90 flessen) te verkrijgen. Hiervoor maken we aangewezen elke fles met behulp van genotype, tijdstip, en de fles brief. Bijvoorbeeld SCA3-27Q 20E betreft de vijfde fles (tien) vliegen expressie Atxn3-27Q verouderd 20 dagen. Zodra de nakomelingen Eclose zijn de vliegen gehandhaafd in afzonderlijke flesjes voorzien van de unieke identificator.
We behielden de aantallen vliegen verkregen voor elk monster, fles, en verzamelpunt ('s ochtends en' s avonds) in een Excel-spreadsheet. We herzien het aantal vliegen per flesje voor het invriezen rekening te houden letaliteit en ontsnapte. Van die laatste telt, kan flacons toevoegen van 200 vliegen gemakkelijk te vinden voor het openen van de vriezer, en aldus bijdragen tot het behoud van de monsters. Omdat vliegen verzameld uit een fles kan alleen worden gebruikt in een Rep, we gemaximeerd hun bijdrage per biologische herhaling, hoewel alle Reps die vliegen vanaf meerdere flessen. We reserveerdende vliegen van flessen niet in de geprogrammeerde Rep andere Reps als vervanging samples, of andere experimenten (western blot, qPCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Voortbouwend op onze eerdere ervaringen in transcriptomics 11, 12, metabolisme 15, en neurodegeneratieve ziekten 6, 8, presenteren we hier een nieuw protocol voor het verzamelen van duizenden vliegen hoofden met volwassen-specifieke expressie van pathogene genen, en het zuiveren van mRNA en metabolieten voor RNA- seq en NMR spectroscopie, respectievelijk. De aard van deze experimenten vereist de opname van verschillende innovaties vóór de fly collectie, inclusief de selectie van een alomtegenwoordige Gal4 lijn en het gebruik van temporele regulering van de genexpressie. Wat Gal4, alomtegenwoordige expressie van de transgenen was cruciaal om twee redenen. Eerst een groot aantal genen betrokken bij neurodegeneratieve ziekten, waaronder ATXN3, Huntingtine, Amyloid precursor eiwit pt Superoxide dismutase 1 oa komen algemeen voor in neuronale en gliale cellen als in andere celtypen buiten het zenuwstelsel. We wildencorrect modelleren dit aspect van de biologie van deze pathogene genen door het analyseren van de gevolgen van de alomtegenwoordige expressie in plaats van zich uitsluitend te richten op neurale expressie. Ten tweede, is het niet haalbaar om te vliegen hersenen te verzamelen in grote aantallen, maar we kunnen dit doen met fly koppen (meer dan 200 in drievoud per conditie) 11, 12. Sinds homogenisering van hele kroppen mengt neurale en niet-neurale weefsels, alomtegenwoordige transgenexpressie wordt van cruciaal belang voor het verkrijgen van een uniforme RNA en metabolieten van populaties van cellen die dezelfde transgenen. Het is belangrijk op te merken dat da-Gal4 werd gekozen vanwege de relatief gelijkmatige verdeling niet, vanwege de hoge expressie, hoewel een recent verslag concludeerde dat da-Gal4 niet helemaal alomtegenwoordig 25. We hadden eerder overwogen andere alomtegenwoordige Gal4 lijnen, met inbegrip van arm-, bad-, pt wet-GA4, maar ze hebben allemaal complexe expressiepatronen toonde in de volwassen CZS en de spieren, waardoor ze minder eendequate voor deze studie. In feite is de immunofluorescentie in volwassen hersenen bleek dat da-Gal4 algemeen, maar zwakke expressie die alleen geaccumuleerd op hoge niveaus in hersenkernen uit enkele duizenden axonen en in enkele grote neuronen (Figuur 2) induceert. Hoewel de expressie van de constructen waren laag, deze omstandigheden drastisch verminderd overleving in een polyQ-afhankelijke manier. Deze uitdrukking dynamiek voldeed aan onze behoeften terwijl expressie niveaus laag zijn, wat belangrijk was voor het waarnemen van de langzame, progressieve cellulaire veranderingen veroorzaakt door neurotoxische eiwitten.
Een voorspelbare consequentie induceren alomtegenwoordige expressie van neurotoxische eiwitten was dat letaliteit voor volwassen verpopping veroorzaakt. Gelukkig deze complicatie was omzeild met het gebruik van Gal80 ts. Zoals hierboven besproken, genexpressie maximale bereikte ongeveer 48 uur na de temperatuurverandering, die goed past bij de tijd frame van het experiment. Een extra voordeel van het gebruik Gal80 ts was dat, in tegenstelling tot de experimenten waarbij neurotoxische eiwitten constitutief zijn pan-neuraal expressie was er geen expressie tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Daarom wordt het gebruik van Gal80 ts ook een "schoon" achtergrond waar het zenuwstelsel niet de toxische activiteit van deze eiwitten blootgesteld neurotoxische tijdens gevoelige ontwikkelingsstadia. In onze mening activatie van genexpressie bij volwassenen geleid tot een beter model voor deze klasse van volwassen pathologieën. Echter Gal80 ts tevens een aantal complicaties geassocieerd met de temperatuur verandert. Was dat de toename vliegen bij lage temperaturen (18-20 ° C) de levenscyclus vertraagd, waardoor de experimenten significant langer. Ook is het bekend dat groeit vliegen bij hoge temperaturen (29-31 ° C) hun metabolisme, zoals blijkt uit de verkorte levensduur vergeleken met vliegen verouderd bij 25 ° C. versnelt SiNCE de transcriptionele en metabole studies zullen worden uitgevoerd in vliegen leeftijd bij hoge temperatuur, kunnen we verwachten belangrijke veranderingen in cellulaire stress wegen en energiemetabolisme te zien. Dit is waarom het zo cruciaal om twee controles in te voeren om het experiment, een met de niet-pathogene Atnx3-27Q en een niet-verbonden controle uiten LacZ. Deze controles zullen een basis voor genexpressie en metabole veranderingen die gepaard gaan met een hoge temperatuur, zodat we kunnen identificeren die veranderingen direct verband houden met de uitdrukking van giftige Atxn3. Algemeen, hebben we een aantal aanpassingen aan het verzamelen van vliegen die tal van voordelen bieden – en een paar nadelen (temperatuur kwesties en volgende paragraaf) – voor het bestuderen van ouderdomsdiabetes, progressieve ziekten.
Hoewel de tijdelijke regeling met Gal80 ts was een nuttige toevoeging is, het ingevoerd een onverwachte complicatie. Terwijl het genereren van de vliegen die zowel Gal80 ts eennd da-Gal4 constructies in een stabiele voorraad, merkten we dat vliegt dubbel homozygoot zijn voor beide constructen waren levensvatbaar is, maar steriel. Sinds homozygote Gal80 ts pt da-Gal4 stammen waren levensvatbaar en vruchtbaar zelf, is het niet duidelijk waarom de combinatie lage vruchtbaarheid weergegeven. Het is al enige tijd bekend dat Gal4 is licht toxisch voor Drosophila weefsels 22. Het is mogelijk dan dat de heterologe expressie van de gist transcriptionele repressor Gal80 bijgedragen tot de toxiciteit van Gal4 door te interfereren in potentie de endogene transcriptieapparaat. Deze toxiciteit kan worden versterkt door de alomtegenwoordige verdeling van Gal4 onder controle van da, een gen dat een sleutelrol speelt in de vroege ontwikkeling en seksuele bepalen. Ongeacht de onderliggende oorzaken van de steriliteit, breidden we de Gal80 ts, da-Gal4 vliegen door het handhaven van een balancer chromosoom over da-Gal4 terwijl de homozygosity voor Gal80 t s, suggereert dat Gal4 een kritischer bijdrage aan de steriliteit. Deze oplossing was belangrijk omdat we honderden van deze mannen elke week te kruisen met elk van de UAS transgenen. Echter, kruist het dragen van een balancer gemaakt meerwerk bij de selectie van de juiste nageslacht. Slechts een vierde (25%) van het nageslacht werd verzameld (vrouwen niet balancer) die toegevoegd selectie tijd verminderde de opbrengst per fles, en verhoogde het aantal flessen nodig om ten minste 200 vliegen per genotype verkrijgen / / tijd repliceren punt. Al met al het verzamelen van vliegen werd tijdrovend vanwege de benodigde grote sets, zijn we ervan overtuigd dat het bestuderen van cellulaire veranderingen slechts een paar uur na het inschakelen van de expressie van pathogene genen alomtegenwoordig zal nieuwe en interessante processen die betrokken zijn bij progressieve neuronale verlies te identificeren.
Zodra de genetische ontwerp was op zijn plaats, we speciale aandacht besteed aan deexperimentele manipulaties die biologische variabiliteit zou kunnen introduceren. Eerst hebben we alleen verzameld virgin vrouwtjes de homogeniteit van de monsters te verzekeren, hoewel dit betekende weggooien mannetjes en controleren op nageslacht tweemaal daags. Tijdens veroudering, werden niet meer dan 12 vliegen bewaard in dezelfde flacon om overbevolking en stress te vermijden. Ook voor het invriezen, werden vliegen overgebracht naar cryovials zonder verdoving en mochten om te herstellen van de overdracht gedurende 30 minuten. Deze schijnbaar triviale factoren van invloed kunnen zijn genexpressie en het metabolisme, de invoering van de variabiliteit in de uiteindelijke analyse die niet relevant zijn voor het experiment.
Om de kwaliteit van de bevroren materialen (koppen, RNA en metabolieten) te garanderen, hebben we speciale aandacht besteed aan elk detail dat kan bijdragen aan weefsel degradatie. Omdat vliegen worden overgebracht naar cryovials in kleine aantallen (tot 12 vliegen per flacon), moesten we veel flesjes halen voor het verzamelen van 200 hoofden. Deze manipulaties werden deen uiterst zorgvuldig in een koude kamer met droogijs en vloeibare stikstof. Het verzamelen van vliegen, scheiding van koppen en zuivering van informatie moleculen te tijdrovend om te ontdekken dat het materiaal was afgebroken eind dit lange proces. Naast zorgen dat het materiaal de kwaliteit behoudt dit protocol beschrijft verschillende stappen die de opbrengst van RNA en metabolieten zoals vriesdrogen en kralen slaan maximaliseren. Deze stappen zijn niet nodig voor normale extracties voor RT-PCR of kwantitatieve PCR van gehele vliegen, maar ze zijn kritisch voor consistente zuivering van kleine monsters zoals fly koppen. We hebben vastgesteld dat andere stappen de opbrengst van RNA beïnvloeden. Bijvoorbeeld oudere vliegen aanzienlijk minder dan jongere RNA vliegen, ongeacht het genotype. Deze waarneming suggereerde dat veroudering bij hoge temperatuur dramatische veranderingen induceert. Ook, het extraheren van RNA van 100 hoofden was eigenlijk efficiënter dan van 200 hoofden, dus gingen we naar zuiveren in twee batches van 100 per monster, alleen om ze te combineren na controle van kwaliteit met de Bioanalyzer. Ook kolommen voor zuivering mRNA leek eenvoudig verzadigen, zodat de totale hoeveelheid RNA die per kolom worden geoptimaliseerd.
Metabolieten zijn een mix van kleine moleculen, dus kwaliteitscontrole moeilijker dan met DNA, RNA of eiwitten. Helaas is er geen volledige catalogus van metabolieten een dier model op dit moment, iets dat kan in de komende jaren te veranderen door de toepassing van verschillende technologische innovaties, zoals NMR spectroscopie en het uitgebreide gebruik van vloeibare chromatografie – massaspectrometrie ( LC-MS). Hoewel de NMR is minder gevoelig dan MS, toont veelbelovende voordelen, waaronder geen vernietiging van monsters geen analytische procedures bias (LC) in te voeren en hoge reproduceerbaarheid dat statistische vergelijking van Reps en verschillende experimentele omstandigheden 24 maakt. Aldus kan de steekproefopnieuw getest om vaststellingen te verifiëren of opnieuw geanalyseerd met LC-MS aan NMR-gegevens te valideren. Hier toonden we voorlopige NMR-gegevens van vliegen die we gebruiken om een catalogus van metabolieten in Drosophila samen te stellen. Deze informatie zal van cruciaal belang zijn om te bepalen hoe de expressie van pathogene genen normale stofwisseling verandert, het openen van een nieuw venster op het verder begrijpen van de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan neurodegeneratieve ziekten.
Nieuw opkomende nomische technologieën bieden de beste kans om neurodegeneratieve ziekten studeren aan een mate van detail die niet eerder bereikt. Misschien wel het grootste obstakel te overwinnen in deze high-throughput studies is de trouwe verzameling van reproduceerbare monsters dat kan worden geanalyseerd met zeer gevoelige methoden. De procedures die hier een manier om deze consistentie te bereiken, en zal leiden tot resultaten die eenvoudig kunnen worden vergeleken over datasets. Hoewel onze primair onderzoek betrokken belangen onderzoekt veranderingen van gen tot expressieion en metabolieten kunnen gegenereerde vliegen eveneens aan proteomische of epigenomisch analyse. Proteomische en epigenomisch veranderingen die zich in de loop van neurodegeneratie zijn waarschijnlijk ook van het grootste belang om de ziekte-proces. Wanneer de wetenschappelijke gemeenschap uiteindelijk het volledige spectrum van moleculaire veranderingen invloed het ziekteproces identificeert, een ware systeemniveau begrip van de ziekte mogelijk. Op dit niveau zal disease-modifying therapieën uiteindelijk naar voren als een realiteit.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn dankbaar voor Janice Santiago, Gabriel Figueroa, en Jose Herrera voor technische bijstand en de Bloomington Drosophila Stock Center aan de Universiteit van Indiana voor vlieg voorraden. DH en CW werden ondersteund door fondsen van NSF-IOS-1051890. PF-F en LMM werden ondersteund door een Opportunity Seed Fund van de Universiteit van Florida.
Materials
| Reagent | Company | Cat. Number | Comments |
| Jazz mix Drosophila food | Fisher Scientific | AS-153 | |
| Cryogenic Vials | Corning, Inc. | 430658 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-175-C-S | |
| RNaseZap | Ambion | AM9786 | Treat all surfaces |
| 5/32″ grinding balls, stainless steel | OPS Diagnostics | GSS 156-5000-01 | |
| TRIzol | Ambion | 15596018 | |
| 1-bromo-3-chloropropane | Sigma | B9673-200ML | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| DEPC-treated water | Fisher Scientific | BP561-1 | |
| DNase I | Promega | M6101 | |
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification kit | Invitrogen | 610-06 | |
| Conical Screw Cap Tubes | Fisher Scientific | 02-681-344 | |
| Screw Caps w/O-Rings | Fisher Scientific | 02-681-364 | |
| 2.0 mm Zirconia beads | BioSpec Products | 11079124zx | |
| Methanol, HPLC-grade | Fisher Scientific | A4524 | |
| Chloroform, HPLC-grade | Acros organics | AC39076 | |
| Drosophila Stocks | |||
| da-Gal4 | Bloomington Stock Center | 5460 | |
| Gal80[ts] | Bloomington Stock Center | 7108 | |
| UAS-MJD-27Q | Bloomington Stock Center | 8149 | |
| UAS-MJD-78Q | Bloomington Stock Center | 8150 | |
| UAS-LacZ | Bloomington Stock Center | 8529 | |
| Equipment | |||
| Inject+Matic Sleeper | INJECT+MATIC | ||
| Microsieve Set | Fisher Scientific | 3410531 | Use two largest meshes |
| Geno/Grinder 2000 | SPEX Sample Prep | SP2100-115 | |
| Sorvall Legend Microcentrifuge | ThermoScientific | 75002436 | |
| FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System | LabConco | 7670041 | |
| BioAnalyzer v. 2.6 | Agilent | 2100 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Fast Prep bead-beater | ThermoScientific | FP120 | |
| Centrivap Vacufuge Plus | Labconco | 022820001 |
Referências
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat. Rev. Neurosci. 11, 514-522 (2010).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6, 9-23 (2005).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bundy, J. G., Papp, B., Harmston, R., Browne, R. A., Clayson, E. M., Burton, N., Reece, R. J., Oliver, S. G., Brindle, K. M. Evaluation of predicted network modules in yeast metabolism using NMR-based metabolite profiling. Genome Res. 17, 510-519 (2007).
- Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Sanchez-Garcia, J., Gomez-Velazquez, M., Rincon-Limas, D. E., Fernandez-Funez, P. The ER stress factor XBP1s prevents amyloid-beta neurotoxicity. Hum. Mol. Genet. 20, 2144-2160 (2011).
- Fan, T. W. M. Metabolite Profiling by One and Two-Dimensional NMR Analysis of Complex Mixtures. Proress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 28, 161-219 (1996).
- Fernandez-Funez, P., Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Gomez-Velazquez, M., Morales-Garza, M. A., Cepeda-Nieto, A. C., Castilla, J., Soto, C., Rincon-Limas, D. E. In vivo generation of neurotoxic prion protein: role for hsp70 in accumulation of misfolded isoforms. PLoS Genet. 5, e1000507 (2009).
- Fernandez-Funez, P., Nino-Rosales, M. L., de Gouyon, B., She, W. C., Luchak, J. M., Martinez, P., Turiegano, E., Benito, J., Capovilla, M., Skinner, P. J., McCall, A., Canal, I., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y., Botas, J. Identification of genes that modify ataxin-1-induced neurodegeneration. Nature. 408, 101-106 (2000).
- Fernandez-Funez, P., Zhang, Y., Casas-Tinto, S., Xiao, X., Zou, W. Q., Rincon-Limas, D. E. Sequence-dependent prion protein misfolding and neurotoxicity. J. Biol. Chem. 285, 36897-36908 (2010).
- Graze, R. M., McIntyre, L. M., Main, B. J., Wayne, M. L., Nuzhdin, S. V. Regulatory divergence in Drosophila melanogaster and D. simulans, a genomewide analysis of allele-specific expression. Genética. 183, 547-561 (2009).
- Graze, R. M., Novelo, L. L., Amin, V., Fear, J. M., Casella, G., Nuzhdin, S. V., McIntyre, L. M. Allelic imbalance in Drosophila hybrid heads: exons, isoforms, and evolution. Mol. Biol. Evol. 29, 1521-1532 (2012).
- Greene, J. C., Whitworth, A. J., Kuo, I., Andrews, L. A., Feany, M. B., Pallanck, L. J. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4078-4083 (2003).
- Gunawardena, S., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport and neuronal viability by amyloid precursor protein mutations in Drosophila. Neuron. 32, 389-401 (2001).
- Hahn, D. A., Denlinger, D. L. Energetics of insect diapause. Annu. Rev. Entomol. 56, 103-121 (2011).
- Kawaguchi, Y., Okamoto, T., Taniwaki, M., Aizawa, M., Inoue, M., Katayama, S., Kawakami, H., Nakamura, S., Nishimura, M., Akiguchi, I., et al. CAG expansions in a novel gene for Machado-Joseph disease at chromosome 14q32.1. Nat. Genet. 8, 221-228 (1994).
- Lee, F. W., Akiguchi, S. C. The use of Trizol reagent (phenol/guanidine isothiocyanate) for producing high quality two-dimensional gel electrophoretograms (2-DE) of dinoflagellates. J. Microbiol. Methods. 73, 26-32 (2008).
- Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nat. Rev. Genet. 6, 179-193 (2005).
- McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302, 1765-1768 (2003).
- Paulson, H. L., Das, S. S., Crino, P. B., Perez, M. K., Patel, S. C., Gotsdiner, D., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N. Machado-Joseph disease gene product is a cytoplasmic protein widely expressed in brain. Ann. Neurol. 41, 453-462 (1997).
- Pfeiffer, B. D., Ngo, T. T., Hibbard, K. L., Murphy, C., Jenett, A., Truman, J. W., Rubin, G. M. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genética. , 186-735 (2010).
- Rezaval, C., Werbajh, S., Ceriani, M. F. Neuronal death in Drosophila triggered by GAL4 accumulation. Eur. J. Neurosci. 25, 683-694 (2007).
- Rincon-Limas, D., Jensen, K., Fernandez Funez, A. Drosophila models of proteinopathies: the little fly that could. Curr. Pharm. Des. 18, 1108-1122 (2012).
- Robinette, S. L., Ajredini, R., Rasheed, H., Zeinomar, A., Schroeder, F. C., Dossey, A. T., Edison, A. S. Hierarchical Alignment and Full Resolution Pattern Recognition of 2D NMR Spectra: Application to Nematode Chemical Ecology. Anal. Chem. , (2011).
- Simon, A. F., Daniels, R., Romero-Calderon, R., Grygoruk, A., Chang, H. Y., Najibi, R., Shamouelian, D., Salazar, E., Solomon, M., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Diantonio, A., Krantz, D. E. Drosophila vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genética. 181, 525-541 (2009).
- Smith, C. D., Shu, S., Mungall, C. J., Karpen, G. H. The Release 5.1 annotation of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316, 1586-1591 (2007).
- Steffan, J. S., Bodai, L., Pallos, J., Poelman, M., McCampbell, A., Apostol, B. L., Kazantsev, A., Schmidt, E., Zhu, Y. Z., Greenwald, M., Kurokawa, R., Housman, D. E., Jackson, G. R., Marsh, J. L., Thompson, L. M. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
- Tang, F., Barbacioru, C., Nordman, E., Li, B., Xu, N., Bashkirov, V. I., Lao, K., Surani, M. A. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat. Protoc. 5, 516-535 (2010).
- Tare, M., Modi, R. M., Nainaparampil, J. J., Puli, O. R., Bedi, S., Fernandez-Funez, P., Kango-Singh, M., Singh, A. Activation of JNK signaling mediates amyloid-ss-dependent cell death. PLoS One. 6, e24361 (2011).
- Taylor, J. P., Taye, A. A., Campbell, C., Kazemi-Esfarjani, P., Fischbeck, K. H., Min, K. T. Aberrant histone acetylation, altered transcription, and retinal degeneration in a Drosophila model of polyglutamine disease are rescued by CREB-binding protein. Genes Dev. 17, 1463-1468 (2003).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. , 134-3571 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Warrick, J. M., Chan, H. Y., Gray-Board, G. L., Chai, Y., Paulson, H. L., Bonini, N. M. Suppression of polyglutamine-mediated neurodegeneration in Drosophila by the molecular chaperone HSP70. Nat. Genet. 23, 425-428 (1999).
- Warrick, J. M., Paulson, H. L., Gray-Board, G. L., Bui, Q. T., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N., Bonini, N. M. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93, 939-949 (1998).
- Wu, H., Southam, A. D., Hines, A., Viant, M. R. High-throughput tissue extraction protocol for NMR- and MS-based metabolomics. Anal. Biochem. 372, 204-212 (2008).
