Nye verktøy for å utvide Regulatoriske T-celler fra HIV-1-infiserte individer
Summary
CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.
Abstract
CD4 + regulatoriske T-celler (Tregs) er potente immunmodulatorer og tjener en viktig funksjon i menneskers immun homeostase. Nedbryting av Tregs har ført til målbare økninger i antigen-spesifikke T-celle-responser i vaksinesammensetninger innstillinger for kreft og infeksiøse patogener. Imidlertid forblir deres rolle i HIV-1 immuno-patogenese kontroversielt, da de kan enten tjene til å undertrykke skadelige HIV-1-assosiert aktivering av immunsystemet og dermed bremse HIV-1 sykdomsprogresjon eller alternativt undertrykke HIV-1-spesifikk immunitet, og derved fremme virus spre seg. Forståelse og modulerende Treg funksjon i forbindelse med HIV-1 kan føre til potensielle nye strategier for immunterapi eller HIV-vaksiner. Men viktige åpne spørsmål forbli på sin rolle i forbindelse med HIV-1-infeksjon, som må nøye studert.
Representerer ca 5% av menneskelige CD4 + T celler i perifert blod, studere Treg befolkningen har vist seg å være vanskelig, especially hos HIV-1-infiserte individer der HIV-1-assosiert CD4 T celler og med at Treg uttømming oppstår. Karakteriseringen av regulatoriske T-celler hos individer med fremskredet HIV-1-sykdom eller vevsprøver, hvor bare meget små, biologiske prøver kan oppnås, er derfor svært utfordrende. Vi foreslår en teknisk løsning for å overvinne disse begrensningene ved hjelp av isolasjon og utvidelse av Tregs fra HIV-1-positive individer.
Her beskriver vi en enkel og robust metode for å lykkes utvide Tregs isolert fra HIV-1-infiserte individer in vitro. Flow-sorteres CD3 + CD4 + CD25 + CD127 lav Tregs ble stimulert med anti-CD3/anti-CD28 belagte perler og dyrket i nærvær av IL-2. Den utvidede Tregs uttrykte høye nivåer av foxp3, CTLA4 og HELIOS sammenlignet med konvensjonelle T-celler og ble vist seg å være svært undertrykkende. Enklere tilgang til et stort antall Tregs vil tillate forskere å ta important spørsmål om sin rolle i HIV-1 immunpatogenese. Vi mener å svare på disse spørsmålene kan gi nyttig innsikt for utvikling av en effektiv HIV-1 vaksine.
Introduction
Med mer enn 34 millioner mennesker som lever med HIV / AIDS på verdensbasis og anslagsvis 2,5 millioner mennesker smittet i 2011, behovet for en effektiv HIV-vaksine for å dempe den globale HIV-epidemien er fortsatt viktig. Men til tross for tre tiår med intens forskningsinnsats, har HIV-1 vaksine effektstudier hittil resultert i bare beskjeden beskyttelse 1-3 og korrelater til beskyttende immunitet forbli dårlig forstått. Å belyse naturen av immunresponsen nødvendig for beskyttelse er viktig for den strategiske utforming av en effektiv HIV-1-vaksine og andre immunterapeutiske strategier rettet mot HIV-1 infeksjon.
Naturlig CD4 + regulatoriske T-celler (Tregs) er kritiske til vedlikehold av immunceller homeostase ved å kontrollere overdreven aktivering av immunsystemet, og dermed begrense immun-mediert vevsskade. Men de kan også undertrykke immunreaksjoner mot patogener og hindre deres klaring. Kreft og HepaTitis B-vaksine studier har vist at å redusere aktiviteten til Tregs kan forbedre vaksineresponsen og antigen-spesifikk immunitet mot virus 4-7. Men i forbindelse med HIV-1-infeksjon, forblir nøyaktige virkningen av regulatoriske T-celler ufullstendig forstått. Tregs ble vist å redusere virusreplikasjon i aktiverte T-celler 8 og muligens påvirke immunaktivering ni. De ble også vist seg å undertrykke HIV-1-spesifikk immunrespons, som kan ha negative utfall for sykdomsutvikling 10,11. Således, før de blir i stand til å modulere Treg aktivitet for å øke effekten av et HIV-1-vaksine, er det viktig å få ytterligere innsikt i sin funksjon i denne sammenheng sykdommen.
Menneskelige CD4 + regulatoriske T-celler er en relativt knappe celle befolkningen, som representerer ca 5% av CD4 + T celler i perifert blod, og deres absolutte tall ytterligere nedgang med HIV-tilknyttede CD4 + T-celle uttømming 12 </ Sup>. Aktuelle analyser for å vurdere Treg funksjon, for eksempel T-celle spredning analyser med Treg co-kultur, bruker relativt store celle tall 12. Derfor karakterisere funksjon og spesifisitet av regulatoriske T-celler hos personer med fremskredet HIV-1 sykdommen har vært utfordrende, til tross for deres betydning for HIV patogenese.
Den ex vivo isolasjon og utvidelse av Tregs fra HIV-1 pasienter kunne representere en løsning for å overvinne noen av disse begrensningene. Her beskriver vi en enkel og robust protokoll for å utvide funksjonell Tregs avledet fra HIV-1-infiserte individer i vitro, vi videre forklare hvordan du fenotype dem og teste deres undertrykkende funksjon ved hjelp flowcytometrisk analyser. Vi tror denne protokollen vil lette tilgangen til Tregs og hjelp til å forstå sin rolle i HIV-1 sykdomsutvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Using the protocol described above, Tregs can be successfully isolated and expanded from HIV-1-infected individuals in vitro. Expanded Tregs express high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS, are highly suppressive and display a highly demethylated Treg-Specific Demethylation Region (TSDR) locus of the FOXP3 gene (data not shown) 15, suggesting true origin from the regulatory T cell lineage, as opposed to activation-induced transient FOXP3 upregulation. Deep sequencing demonstrated that the TCR repertoir…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by research funding from the Elisabeth Glaser Pediatric AIDS Foundation (Pediatric HIV Vaccine Program Award MV-00-9-900-1429-0-00 to MMA), MGH/ECOR (Physician Scientist Development Award to MMA), NIH NIAID (KO8219 AI074405 and AI074405-03S1 to MMA), and the Harvard University Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI060354) which is supported by the following NIH Co-Funding and Participating Institutes and Centers: NIAID, NCI, NICHD, NHLBI, NIDA, NIMH, NIA, FIC, and OAR. These studies were furthermore supported by the Bill & Melinda Gates Foundation and the Terry and Susan Ragon Foundation.
Materials
| Reagents | |||
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | Stemcells technologies | 15062 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Histopaque | Sigma | H8889 | |
| Anti-CD3-PECy7 | BD Pharmingen | 557851 | |
| Anti-CD4-FITC | eBioscience | 11-0049-42 | |
| Anti-CD25-APC | eBioscience | 17-0259-42 | |
| Anti-CD127-PE | BD Pharmingen | 557938 | |
| Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh | BD Falcon | 352235 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-001-Cl | |
| Human Serum | Gemini Bio-Products | 100-512 | |
| Human T-activator CD3/CD28 | Life Technologies | 111.31D | |
| IL-2 | NIH Aids Research & Reference Reagent Program | 136 | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L34955 | |
| Anti-CD4-qdot-655 | Life Technologies | Q10007 | |
| Anti-CD25-PECy5 | eBiosciences | 15-0259-42 | |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBiosciences | 00-5523-00 | |
| Anti-FOXP3-PE | eBiosciences | 12-4776-42 | |
| Anti-HELIOS-FITC | Biolegend | 137204 | |
| Anti-CTLA4-APC | BD Pharmingen | 555855 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C34557 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Life Technologies | V12883 | |
| HEPES | Mediatech | 25-060-Cl | |
| Treg Suppression inspector | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Anti-CD4-APC | BD Pharmingen | 340443 | |
| Anti-CD8-AF700 | BD Pharmingen | 557945 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Glutamine | Mediatech | 25-002-Cl | |
| Materials | |||
| BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364606 | |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | – | |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | – | |
| FlowJo | Tree Star | v887 |
Referências
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
- Buchbinder, S. P., et al. Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine (the Step Study): a double-blind, randomised, placebo-controlled, test-of-concept trial. Lancet. 372 (08), 1881-1893 (2008).
- Pitisuttithum, P., et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled efficacy trial of a bivalent recombinant glycoprotein 120 HIV-1 vaccine among injection drug users in Bangkok, Thailand. J. Infect. Dis. 194, 1661-1671 (2006).
- Morse, M. A., et al. Depletion of human regulatory T cells specifically enhances antigen-specific immune responses to cancer vaccines. Blood. 112, 610-618 (2008).
- Furuichi, Y., et al. Depletion of CD25+CD4+T cells (Tregs) enhances the HBV-specific CD8+ T cell response primed by DNA immunization. World J. Gastroenterol. 11, 3772-3777 (2005).
- Rech, A. J., Vonderheide, R. H. Clinical use of anti-CD25 antibody daclizumab to enhance immune responses to tumor antigen vaccination by targeting regulatory T cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1174, 99-106 (2009).
- Ruter, J., et al. Altering regulatory T cell function in cancer immunotherapy: a novel means to boost the efficacy of cancer vaccines. Front Biosci. 14, 1761-1770 (2009).
- Moreno-Fernandez, M. E., Rueda, C. M., Rusie, L. K., Chougnet, C. A. Regulatory T cells control HIV replication in activated T cells through a cAMP-dependent mechanism. Blood. 117, 5372-5380 (2011).
- Schulze Zur Wiesch, J., et al. Comprehensive analysis of frequency and phenotype of T regulatory cells in HIV infection: CD39 expression of FoxP3+ T regulatory cells correlates with progressive disease. J. Virol. 85, 1287-1297 (2011).
- Kinter, A., et al. Suppression of HIV-specific T cell activity by lymph node CD25+ regulatory T cells from HIV-infected individuals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3390-3395 (2007).
- Moreno-Fernandez, M. E., Presicce, P., Chougnet, C. A. Homeostasis and function of regulatory T cells in HIV/SIV infection. J. Virol. , (2012).
- Angin, M., et al. Preserved Function of Regulatory T Cells in Chronic HIV-1 Infection Despite Decreased Numbers in Blood and Tissue. J. Infect. Dis. 205, 1495-1500 (2012).
- Seddiki, N., et al. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med. 203, 1693-1700 (2006).
- De Jager, P. L., et al. The role of the CD58 locus in multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 5264-5269 (2009).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
- Salomon, B., et al. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity. 12, 431-440 (2000).
- Malek, T. R., Bayer, A. L. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2. Nat. Rev. Immunol. 4, 665-674 (2004).
- Hoffmann, P., Eder, R., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Edinger, M. Large-scale in vitro expansion of polyclonal human CD4(+)CD25high regulatory T cells. Blood. 104, 895-903 (2004).
- Putnam, A. L., et al. Expansion of human regulatory T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes. 58, 652-662 (2009).
- Kreijveld, E., Koenen, H. J., Hilbrands, L. B., Joosten, I. Ex vivo expansion of human CD4+ CD25high regulatory T cells from transplant recipients permits functional analysis of small blood samples. J. Immunol. Methods. 314, 103-113 (2006).
- Ebinuma, H., et al. Identification and in vitro expansion of functional antigen-specific CD25+ FoxP3+ regulatory T cells in hepatitis C virus infection. J Virol. 82, 5043-5053 (2008).
- Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS ONE. 4, e5994 (2009).
- Heredia, A., et al. Rapamycin causes down-regulation of CCR5 and accumulation of anti-HIV beta-chemokines: an approach to suppress R5 strains of HIV-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10411-10416 (1073).
- Hoffmann, P., et al. Only the CD45RA+ subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneous regulatory T-cell lines upon in vitro expansion. Blood. 108, 4260-4267 (2006).
- Hoffmann, P., et al. Loss of FOXP3 expression in natural human CD4+CD25+ regulatory T cells upon repetitive in vitro stimulation. Eur. J. Immunol. 39, 1088-1097 (2009).
- Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J. Exp. Med. 192, 303-310 (2000).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. J. Immunol. 184, 3433-3441 (2010).
- Zheng, S. G., Gray, J. D., Ohtsuka, K., Yamagiwa, S., Horwitz, D. A. Generation ex vivo of TGF-beta-producing regulatory T cells from CD4+CD25- precursors. J. Immunol. 169, 4183-4189 (2002).
- Gregori, S., Roncarolo, M. G., Bacchetta, R. Methods for in vitro generation of human type 1 regulatory T cells. Methods Mol. Biol. 677, 31-46 (2011).
