Lett preferanse analysen å studere medfødte og Circadian Regulert Photobehavior i<em> Drosophila</em> Larver
Summary
Her beskriver vi en lys-mørk preferanse test for Drosophila larve. Denne analysen gir informasjon om medfødte og circadian regulering av lys sensing og behandling photobehavior.
Abstract
Lys fungerer som miljø-signal for å styre dyrs atferd på ulike nivåer. Drosophila larve nervesystemet blir brukt som en unik modell for å svare på grunnleggende spørsmål om hvordan lyset informasjon behandles og deles mellom raske og circadian atferd. Drosophila larver vise en stereotype unngåelsesatferd når de utsettes for lys. For å undersøke lys avhengige atferd forholdsvis enkle lys-mørke preferanse tester kan brukes. I virveldyr og leddyr nervebaner som er involvert i sanse og behandle visuelle innganger delvis overlapper med de prosessering photic circadian informasjon. Den spennende spørsmålet om hvordan lyset følersystem og cirkadisk system samhandler for å holde atferdsmessige utganger koordinert stort sett forblir uoppdaget. Drosophila er en påvirker biologisk modell for å nærme seg disse spørsmål, på grunn av et lite antall av neuroner i hjernen og tilgjengeligheten av genetiske verktøy for neuronal manipulasjon. Den presenterte lys-mørke preferanse analysen gjør at etterforskningen av en rekke visuelle atferd inkludert circadian kontroll over phototaxis.
Introduction
Her beskriver vi et atferdsmessig analysen basert på larvenes preferanse for mørk (eller lys). Larver reagerer med en sterk og stereotyp photonegative respons under beite stadier (L1 til tidlig L3) 1. Analysen er beregnet til å vurdere photophobic oppførselen til larven og sammenligner den lyse eller mørke preferanse for en gruppe larver bevege seg fritt i en petriskål belagt med agar. Dette atferdsmessige analysen ikke bare gir informasjon om følsomhet, integrering og temporal plastisitet av det visuelle system, gir det ytterligere tips om hvordan lysfølsomhet og prosessen styres av den biologiske system.
Drosophila larve øyet (også kalt Bowlig Organ, BO), er det viktigste organ for lys oppfatning. Hvert øye er sammensatt av 12 fotoreseptorer (PR), åtte PRS uttrykke den grønne-sensitive rhodopsin6 (rh6) og fire PRS uttrykke den blå-sensitive rhodopsin5 (RH5) 2,3. I tillegg til PRS, also klasse IV multidendritic nevroner, som dekker larve kroppen veggen, har blitt identifisert til å reagere på skadelige lysintensitet 4,5. Det er også kjent at pacemaker nevroner som ligger i den sentrale larve hjerne uttrykker den lysfølsomme proteinet Cryptochrome (Cry) som virker som klokke iboende blå lys-sensor i hjernen 6,7. Forbløffende photophobicity av vill type dyr viser en circadian komponent ved ulike tidspunkt i løpet av dagen og natten når du tester med denne analysen. Svar på bakgrunn av beite L3 larve viste sterkere photophobicity ved daggry og lavere photophobicity i skumringen når testet for lys-mørke preferanse 7. Interessant bare RH5-PRS er nødvendig for lys unngåelse, mens rh6-PRS er unnværlig. Både RH5-PRS og rh6-PRS er involvert i å tilbakestille molekylær klokke med lys 8. The Cry veien skal koordineres med de andre lys-sensing veier å orkestrere en passende behavioral utgang iløpet av dagen. Acetylkolin i PRS spiller en vesentlig rolle i lys unnvikelsesatferd samt innblanding av molekylære klokke. Blokkering acetylkolin neurotransmission fra PRS til døgnrytmen pacemaker nevroner reduserer photophobic respons i lys-mørke preferanse analysen åtte. Ved å anvende den samme analysen, har to symmetriske par av nevroner nylig blitt identifisert for å slå på lyset preferanse for den tredje instar larver av Drosophila 9.. Disse to parene av nerveceller kan fungere under sene larvestadier, da dyrene forlater maten antagelig finne en passende pupariation nettstedet. Imidlertid gjenstår spørsmålet om hvordan de visuelle trasé samhandle og kontrollere larve visuell atferd i en circadian måte i stor grad ubesvart. Lyset preferanse analysen gjør sammenligninger mellom døgnrytmen tidspunkter, fly linjer og biologiske tilstand under forskjellige lys kvaliteter. Analysen fremstilles lett og billig og har vært nyttig tidligere jegn flere laboratorier for å beskrive og studere lys avledet atferd i larve.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lyset preferanse testen beskrevet utnyttet larve medfødt photobehavior. Analysen er enkel å etablere, gjør at mange repetisjoner til lave kostnader og leverer verdifull informasjon om lys sensing og behandling. Den eksperimentelle paradigmet gir relativt rask kvantifisering av hvor mange individer foretrekker lys eller mørk. Slike preferanser kan vises som grove prosenter eller alternativt som preferanse Index (PREF). Den PREF er uttrykt som differansen av dyr som foretrukne lys og dyr som foretrukket mørke divider…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker våre kolleger ved Institutt for biologi, Universitetet i Fribourg for fruktbare diskusjoner. Vi takker Bloomington Stock Center for å gi fly aksjer. Dette arbeidet ble støttet av den sveitsiske National Science Foundation (PP00P3_123339) og Velux Foundation til SGS
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A5093-500G | 2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland |
| Petri dishes | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | 90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria |
| LEDs Lamp | OSARAM | 80012 White | LED lamp, 80012 White |
| Environment Meter | PCE | PCE EM882 | Lux, Temp, RH% |
| Thermostatic cabinet | Aqua Lytic (Liebherr) | ET636-6 | |
| Light timer | Timer T | 6185.104 | 230V/50HZ (check specifications for your country) |
| Universal thermostat | Conrad | UT200 | |
| Humidifier | Boneco | ||
| Balck tape | Tesa | 5 cm | |
| Glue | Uhu | ||
| lncubator lamp | Phillips | Softtone | 5W |
| Timer clock | Ziliss | Ziliss, Switzerland | |
| Excel Software | Microsoft | Excel | |
| Origin Software 8.5 | OriginLab | ||
| Backer Yeast | Migros Switzerland | ||
| Iron support stand 17X28CM | Fisher Scientific | S47808 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283-100ML | 20% acetic acid dilluted in H2O |
| Red light lamp | Phillips | PFE712E*8C | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Power supply | EA | EA PS 2042-06B | Optional |
| Aluminium foil | Prix Coop | ||
| Heater | GOON | NSB200C | |
| Microwave Oven | Intertronic | ||
| Standard corn meal fly food | |||
| Destilled water |
Referências
- Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development. J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).
- Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates. Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454, 533-537 (2008).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Diaz, N. N., Sprecher, S. G. Photoreceptors: unconventional ways of seeing. Curr. Biol. 21, R25-R27 (2011).
- Emery, P., et al. Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor. Neuron. 26, 493-504 (2000).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, 293-300 (2005).
- Keene, A. C., et al. Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment. J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).
- Gong, Z. F., et al. Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference. Science. 330, 499-502 (2010).
- Lilly, M., Carlson, J. smellblind: a gene required for Drosophila olfaction. Genética. 124, 293-302 (1990).
- Bodenstein, D., Demerec, M. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).
- Pittendrigh, C. S. Circadian systems: Entrainment. Biological Rhythms. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, 95-124 (1981).
- Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila. Neuron. 74, 706-718 (2012).
- Keene, A. C., Sprecher, S. G. Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae. Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).
