Isolierung humaner Vorhofmyozyten für gleichzeitige Messungen von Ca^{2 +} Transienten und Membrane Currents

Experimentelle Protokolle müssen von der lokalen Ethikkommission genehmigt werden und alle Patienten müssen eine schriftliche Einverständniserklärung geben. Unsere Forschung wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg (# 2011-216N-MA) zugelassen und wurde in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen der Menschen durchgeführt. Alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung. 0. Gewinnung von menschlichem Vorhofgewebe Im Routinebetrieb Kanülierung Verfahren bei Patienten mit Operationen am offenen Herzen für Herz-Lungen-Bypass-Operation, wird die Spitze des rechten Herzohr Regel entfernt und zur Isolierung von atrialen Kardiomyozyten verwendet werden. Nach Exzision der Gewebeprobe wird sofort in einem 50 ml Falcon-Röhrchen mit sterilem Ca 2 +-freien übertragen Transportlösung mit 2,3-butanedione Monoxim (Tabelle I; BDM, kontraktilen Inhibitor, verhindert myocyte contracture). Mit Transportzeiten zwischen 30 und 45 min, haben wir nicht erkennen, einen klaren Vorteil von Kühl-oder Sauerstoffversorgung sowohl in Bezug auf Anzahl und Qualität der isolierten atrialen Kardiomyozyten. Im allgemeinen Transport zum Labor sollte so schnell wie möglich. Allerdings, wenn längere Transportzeit nicht vermieden werden kann, Transport bei 4 ° C in sauerstoffhaltigen Lösung könnte von Vorteil sein. 1. Prearrangements Schalten Sie den Thermostatenkreislauf, der die Temperatur der ummantelten Becherglas (Tabelle II) steuert. Achten Sie darauf, die Temperatur innerhalb des Bechers beträgt 37 ° C. Das Becherglas wird mit einem Glasdeckel, um eine konstante Temperatur im Becherglas während der gesamten Trennung aufrechtzuerhalten. Wiegen Sie die Collagenase I und Protease XXIV in drei Bechergläser und speichern Sie es bei Raumtemperatur. Die Enzyme werden unmittelbar vor der Anwendung verdünnt werden. Shop 20 ml Ca 2 + freier Lösung in einer Petrischale bei 4 ° C. Shop 250 ml von Ca 2 + freier Lösung in einem Wasserbad bei 37 ° C 2. Reinigung des Tissue Übertragen Sie die Gewebeprobe zusammen mit dem Transport-Lösung in eine Petrischale (~ 10 cm Durchmesser) und entfernen Fettgewebe grob mit einer Schere. Wiegen Sie die Gewebeprobe. Zwischen 200 und 600 mg sind für die Zell-Isolierung verwendet. Der verbleibende Gewebe in flüssigem Stickstoff für eine spätere biochemische Analyse eingefroren. Übertragen Sie die Gewebeprobe in die Petrischale mit 20 ml Ca 2 + kostenlose Lösung bei 4 ° C (siehe Schritt 1.3) und hacken die Gewebeprobe in kleine Stücke von etwa 1 mm 3 in der Größe. Die folgenden Schritte sollten bei 37 ° C und unter ständiger Begasung mit 100% O 2 ausgeführt werden. Eine Pipettenspitze auf die Sauerstoff-Schlauch gelegt werden, um starke Blasenbildung zu vermeiden und kontinuierliche Luftstrom erzeugen. Übertragen Sie die Gewebe Stücke zusammen mit dem Ca 2 +-freie Lösung inder ummantelten Becherglas und rühren Sie vorsichtig für etwa 3 min mit einem magnetischen Rührstab. Stoppen Rühren und lassen Sie die Stücke Gewebe niederlassen für ein paar Sekunden. Vorsichtig belasten den Überstand durch ein feinmaschiges (200 um, Tabelle II). Bringen Sie die verhaltene Gewebe Brocken aus dem Netz in das Becherglas mit einer Pinzette. Refill das Becherglas mit Ca 2 + kostenlose Lösung und wiederholen Sie den Waschschritt 2.4 und 2.5 zwei mal. 3. Erste enzymatische Verdauung Re-suspend die Gewebe Brocken mit 20 ml Enzymlösung E1 (Tabelle I), die Kollagenase und Protease und vorsichtig umrühren für 10 min. In 40 ul 10 mM CaCl 2-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 20 &mgr; M Ca 2 + erhalten. Nach 35 min Belastung der Überstand vorsichtig durch ein Nylonnetz (200 um, Tabelle II) in einer Weise, dass die meisten der Stücke Gewebe im Becherglas verbleiben. Zurück Restregnete Gewebe Brocken aus dem Netz in das Becherglas. 4. Second enzymatische Verdauung Resuspendieren der Gewebe Brocken wieder mit 20 ml Enzymlösung E2 mit Kollagenase ich nur (Tabelle I). In 40 ul 10 mM CaCl 2-Lösung sofort, um eine Endkonzentration von 20 &mgr; M Ca 2 + erhalten. Während der zweiten Verdauung Verwendung Schere weiter zu hacken Gewebe Blutgerinnsel gelegentlich. Nach 5 min eine Probe mit einer Pasteurpipette auf die Dissoziation von Zellen zu überprüfen. Wiederholen Sie diese alle 2-3 min bis stabförmigen, gestreift Kardiomyozyten erscheinen. Stoppen Rühren und damit die Gewebe Brocken, um sich niederzulassen für ca. 20-30 sek. Der Stamm der Überstand vorsichtig durch ein feinmaschiges (200 um, Tabelle II) in einem 50 ml Falcon-Röhrchen (Tube A). Bringen Sie die verhaltene Gewebe Brocken aus dem Netz in das Becherglas. Re-suspend die Gewebe Brocken im Becherglas mit 20 ml storage Lösung (Tabelle I) und 10 weitere distanzieren die Zellen durch vorsichtiges mechanisches Verreiben mit 20 ml serologische Pipette mit Spender. Versuchen Sie, Blasenbildung zu vermeiden, da Blasen nachteilig auf das Überleben der Zelle und Qualität sind. Der Stamm der Überstand vorsichtig durch ein feinmaschiges (200 um, Tabelle II) in einem 50 ml Falcon-Röhrchen (Tube B). 5. Abschließende Vorbereitung und Einstellung von Final Ca 2 +-Konzentration Zentrifuge sowohl Falcon-Röhrchen A und B (siehe Schritt 4.5 und 4.7) bei 95 g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand von beiden Rohre sorgfältig durch Aspiration. Achten Sie darauf, das Pellet stören. Überstand verwerfen. Re-suspend sowohl Pellets in 1,5 ml-Storage-Lösung (Tabelle I) jede (Raumtemperatur). Fügen Sie zwei mal 7,5 ul 10 mM CaCl 2-Lösung in jedes Falcon und vorsichtig umrühren. Inkubieren für 10 min nach jedem Schritt. In 15 ul 10 mM CaCl 2-Lösung, um eine endgültige Ca 2 +-Konzentration von 0,2 mM zu erhalten. 6. Laden von Myozyten mit dem fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator Fluo-3 AM (Abbildung 1) Übertragen 1,5 ml Zellsuspension (Röhrchen A und / oder das Rohr B) in ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf-Röhrchen). Die folgenden Schritte sollten unter Berücksichtigung der Lichtempfindlichkeit des fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator Fluo-3 ausgeführt. Lösen Sie 50 ug der Membran durchlässig Acetoxymethylester Derivat Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabelle III) in 44 ul der Pluronic F-127 (Tabelle III) stock Lösung (20% w / v in wasserfreiem DMSO) zu erhalten eine 1 mM Fluo-03.00 Lager-Lösung, die bei -20 ° C für höchstens 1 Woche gelagert werden können. In 15 ul der Fluo-03.00 Stammlösung der Mikrozentrifugenröhrchens mit 1,5 ml Zellsuspension (siehe Schritt 6.1) und agitierensorgfältig. Inkubation der Zellsuspension für 10 min in einem optisch undurchsichtige Box. Kurz bei etwa 6.000 rpm zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1,5 ml Badlösung (Tabelle IV). Verlassen Sie die Zellsuspension für etwa 30 min für Entesterung vor Beginn mit Experimenten. 7. Gleichzeitige Patch-Clamp-und Epifluoreszenz Ca 2 + Messungen Seit dem Patch-Clamp-Messungen sind nicht das große Thema dieser Bewertung verweisen wir den interessierten Leser auf andere Publikationen Bereitstellung eines genauere Beschreibung dieser Technik. 11-14 Aus Gründen der Vollständigkeit stellen wir eine kurze Zusammenfassung eines Protokolls zu messen Aktionspotentiale oder L-Typ-Ca 2 +-Ströme, die beide bei gleichzeitiger Ca 2 +-Transienten-Aufnahmen. Bei Versuchen Myozyten werden bei 37 ° C mit Bad Lö superfundiertauf (Tabelle IV) mit einem schnellen Perfusion System (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Für Voltage-Clamp-Experimente, K +-Ströme durch Zugabe von 4-Aminopyridin (5 mmol / l) und BaCl 2 (0,1 mmol / L) der Badlösung blockiert. Borosilikatglas Mikroelektroden verwendet werden und sollte kippen Widerstände von 2-5 MOhm haben, wenn sie mit Pipette Lösung (Tabelle V) gefüllt. Neben der Fluo-3 AM des Myozyten Laden (siehe Schritt 6) wird Fluo-3 auch in der Pipette Lösung (Tabelle V) enthalten. Fluoreszenz wird bei 488 nm angeregt und emittiert Licht (<520 nm) auf [Ca 2 +] i vorausgesetzt umgewandelt wo k d = Dissoziationskonstante von Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3-Fluoreszenz;. F max = Ca 2 +-gesättigten Fluoreszenz am Ende jedes Experiments 12 erhaltenen beiden elektrischen Signalen und epifluoreszenten Ca 2 +-Signale werden gleichzeitig erfasst. Aktionspotentiale werden in 0,5 Hz in Current-Clamp-Modus mit 1 ms Stromimpulse 1.2x Schwelle Stärke stimuliert. L-Typ-Ca 2 +-Ströme werden in Voltage-Clamp-Modus mit einem Haltepotential von -80 mV und eine 100-ms-Impulses Rampe bis -40 mV, die schnellen Na +-Strom, gefolgt von einer 100-ms gemessen inaktivieren Test-Impuls auf +10 mV bei 0,5 Hz liegt.