عزل Myocytes الأذيني الإنسان للقياسات في وقت واحد من الكالسيوم<sup> 2 +</sup> العابرون والتيارات غشاء
Summary
وصفنا عزلة myocytes الأذيني الإنسان والتي يمكن استخدامها لكا داخل الخلايا<sup> 2 +</sup> القياسات في تركيبة مع دراسات التصحيح، المشبك الكهربية.
Abstract
دراسة الخصائص الكهربية من القنوات الأيونية القلب مع تقنية التصحيح، المشبك واستكشاف القلب الخلوية كا 2 + التعامل مع التشوهات العضلية يتطلب معزولة. وبالإضافة إلى ذلك، إمكانية للتحقيق myocytes من المرضى الذين يستخدمون هذه التقنيات هو شرط لا تقدر بثمن لتوضيح الأساس الجزيئي لأمراض القلب مثل الرجفان الأذيني (AF). 1 هنا نحن تصف طريقة لعزل myocytes الأذيني الإنسان والتي هي مناسبة لكلا دراسات التصحيح، المشبك والقياسات في وقت واحد من تركيزات + داخل الخلايا كا 2. أولا، يتم المفروم الزوائد الأذيني الحق تم الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب المفتوح إلى قطع الأنسجة الصغيرة ("أسلوب قطعة") وغسلها في كا 2 + خالية حل. ثم يتم هضمها وقطع الأنسجة في كولاجيناز والبروتيني تحتوي على حلول مع 20 ميكرومتر كا 2 +. بعد ذلك، myocytes معزولة هي harveSTED عن طريق الترشيح والطرد المركزي لتعليق الأنسجة. وأخيرا، يتم ضبط كا 2 + التركيز في حل تخزين الخلايا متدرج إلى 0.2 ملم. نناقش بإيجاز معنى كا 2 + والكالسيوم 2 + التخزين المؤقت أثناء عملية العزل، وكذلك تقديم التسجيلات ممثل امكانات العمل والتيارات غشاء، على حد سواء في وقت واحد جنبا إلى جنب مع كا 2 + قياسات عابرة، التي أجريت في هذه myocytes معزولة.
Introduction
دراسة الخصائص الكهربية من القنوات الأيونية القلب مع تقنية التصحيح، المشبك واستكشاف الخلوية كا 2 + تشوهات تتطلب معالجة العضلية معزولة. عادة ما يتم الحصول على هذه عقب التعرض في المختبر عينات من أنسجة القلب إلى الإنزيمات الهضمية (كولاجيناز، هيالورونيداز، ببتيداز الخ). منذ التقرير الأول للعزلة myocytes القلب قابلة للحياة في عام 1955 (2) وقد وضعت كمية كبيرة من البروتوكولات من أجل حصاد العضلية الأذيني البطيني واحد من الأنواع المختلفة بما في ذلك الماوس، الجرذان والأرانب والكلاب والخنازير الغينية والبشرية. في هذا الاستعراض ونحن نركز على عزلة myocytes الأذيني الإنسان. فيما يتعلق بإجراءات لعزل myocytes من الأنواع الأخرى التي تشير إلى "ورثينجتون الأنسجة التفكك دليل" التي تقدمها ورثينجتون بيوكيميائية كورب، الولايات المتحدة الأمريكية ( www.tissuedissociation.com ).
<p class= "jove_content"> وتستمد الأذيني بروتوكولات العزلة خلية عضلية الإنسان عموما من الطريقة الموصوفة من قبل بوستامانتي، وآخرون. 3 هنا نقدم وصفا خطوة بخطوة من تقنية، والتي يتم تكييفها من أسلوب المنشورة سابقا، من أجل الحصول myocytes الأذيني مناسبة ليس فقط للتجارب التصحيح، المشبك ولكن أيضا لفي وقت واحد داخل الخلايا كا 2 + القياسات. 4-11Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نحن تصف طريقة لعزل myocytes الأذيني الإنسان من الزوائد الأذيني حق الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب المفتوح. من اجل استخدام هذه myocytes لقياس عصاري خلوي كا 2 + نحن تكييفها طريقة التي سبق وصفها 4-11 بحذف EGTA من حلول التخزين.
بالفعل في عام 1970 لوحظ أنه على الرغم من myocytes فصل في وجود الكالسيوم 2 + أثناء عملية الهضم، كل منهم في انكماش وغير قابلة للحياة. 16،17 لذلك، يتم تنفيذ عزل خلية في كا 2 + خالية حل. ومع ذلك، فإن إعادة إدخال تركيزات الفسيولوجية للكا 2 + أسفرت السريع كا 2 + تدفق وموت الخلايا. وقد وصفت ذلك بأنه كا 2 + ظاهرة التناقض الذي لوحظ أصلا في قلوب perfused بواسطة زيمرمان وهولسمان 18 تعديلات من وسائل الإعلام بما في ذلك الحد من عزلة الرقم الهيدروجيني إلى 7.0، <سوب> 19 إضافة taurin 20 أو كميات صغيرة من الكالسيوم 2 + (راجع الخطوة 3.2 و 4.1)، 21 فضلا عن تخزين myocytes معزولة في EGTA تحتوي على تخزين حل 22 وقد اقترحت لمنع كا 2 + المفارقة 17 ومع ذلك، فمن المعروف جيدا أن كا 2 + التخزين المؤقت من خلال EGTA يقلل من السعة من نوع L-كا 2 + الحالية التي يسببها كا 2 + سعة عابرة والنتائج في الاضمحلال ثنائي الطور من كا 2 + العابرين. 23 ولذلك، فإننا حذفت EGTA في جميع مراحل عملية عزل كامل من أجل الحصول على كا 2 + العابرين مع الخصائص النموذجية، ويضمحل حيد الطور. لحماية الخلايا من كا 2 + المفارقة رفعنا النهائي كا 2 + تركيز المحلول التخزين بطريقة تدريجية حتى 0.2 ملم.
اختيار كولاجيناز هو على الارجح الخطوة الأكثر أهمية لنجاح العزلة خلية عضلية. كول التقليديةagenases استعدادات الخام تم الحصول عليها من نسج كلوستريديوم وتحتوي على كولاجيناز بالإضافة إلى عدد من proteinases، polysaccharidases والليباز الأخرى. استنادا على collagenases تكوين عامة تنقسم إلى أنواع مختلفة. رثينجتون 24 أنواع كولاجيناز الأول والثاني استخدمت بنجاح لعزل myocytes الأذيني الإنسان. 4-10،15،25-30 في بروتوكول موضح لدينا في الوقت الحاضر نحن نوصي باستخدام كولاجيناز النوع الأول، على الرغم من أننا كنا أيضا قادرة على الحصول على كميات مقبولة من خلايا قابلة للحياة باستخدام كولاجيناز من النوع الثاني. ومع ذلك، وحتى داخل نوع واحد كولاجيناز هناك تباين كبير دفعة إلى دفعة فيما يتعلق بأنشطة الانزيم. تتطلب هذه الاختلافات حذرا اختيار دفعة واختبار مختلف دفعات لتحسين إجراء العزل. وتتوفر أداة دفعة الاختيار على الانترنت من رثينجتون بيوكيميائية شركة ( http://www.worthington-biochem.com / CLS / match.php) يمكن استخدامها للعثور على دفعات المتاحة مع التشكيل التي قد تظهر لتكون مناسبة للعزلة myocytes الأذيني الإنسان. حاليا نحن نستخدم كولاجيناز النوع الأول مع 250 U / ملغ كولاجيناز النشاط، 345 U / ملغ النشاط caseinase، 2.16 U / ملغ النشاط clostripain و 0.48 U / ملغ النشاط زيتية (الكثير # 49H11338).
الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام الإجراء الموضح في هذه المخطوطة يمكن أن تستخدم في غضون 8 الموارد البشرية لدراسات التصحيح، المشبك، كا 2 + قياسات عابرة ومزيج من الاثنين معا. 15 وبالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه الخلايا القياسات من الانكماش الخلوية في استجابة لتحفيز الحقل الكهربائي أو التحفيز الكهربائي باستخدام ماصة التصحيح، المشبك (الملاحظات غير منشورة).
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
In addition, we thank the cardiac surgeons at Heidelberg University for the provision of human atrial tissue and Claudia Liebetrau, Katrin Kupser and Ramona Nagel for their excellent technical support. Special thanks also to Andy W. Trafford for his helpful suggestions and advice during the establishment of the Ca2+ transient measurements. The authors wish to express their deepest gratitude to the members of the Department of Pharmacology and Toxicology (head: Ursula Ravens) of the Dresden University of Technology for the opportunity they offered us to learn basic techniques and skills in cellular electrophysiology and cardiomyocyte isolation.
The authors’ research is supported by the German Research Foundation (Do769/1-1-3), the German Federal Ministry of Education and Research through the Atrial Fibrillation Competence Network (01Gi0204) and the German Centre for Cardiovascular Research, the European Union through the European Network for Translational Research in Atrial Fibrillation (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, large-scale integrating project, Proposal No. 261057) and the European-North American Atrial Fibrillation Research Alliance (ENAFRA) grant of Fondation Leducq (07CVD03).
The schematic overview shown in the video file was produced using Servier medical art.
Materials
| Transport solution | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | Storage solution: 1% |
| BDM | Sigma-Aldrich | 31550 | Transport solution: 30 |
| DL-b-Hydroxy-butyric acid | Sigma-Aldrich | H6501 | Storage solution: 10 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10 |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | Storage solution: 70 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M9397 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100 |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 | Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10 |
| Collagenase I | Worthington | 4196 | Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml |
| Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml* |
| pH | Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40 |
||
| adjusted with | Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH |
||
| Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only. | |||
| Table I. Solutions. | |||
| Company | Catalogue number | ||
| Nylon mesh (200 μm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| Jacketed reaction beaker | VWR | KT317000-0050 | |
| Table II. Specific equipment. | |||
| Company | Catalogue number | ||
| Dimethyl-sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fluo-3 AM (special packaging) | Invitrogen | F-1242 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM. | |||
| Company | Catalogue number | Bath solution | |
| 4-aminopyridine* | Sigma-Aldrich | A78403 | Bath solution: 5 |
| BaCl2* | Sigma-Aldrich | 342920 | Bath solution: 0.1 |
| CaCl2 × 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | Bath solution: 2 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Bath solution: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Bath solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Bath solution: 4 |
| MgCl × 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | Bath solution: 1 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Bath solution: 140 |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | Bath solution: 2 |
| pH | Bath solution: 7.35 | ||
| adjusted with | Bath solution: 1 M HCl | ||
| Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only. | |||
| Company | Catalogue number | Pipette solution | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | Pipette solution: 92 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Pipette solution: 0.02 |
| GTP-Tris | Sigma-Aldrich | G9002 | Pipette solution: 0.1 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Pipette solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Pipette solution: 48 |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Pipette solution: 1 |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Pipette solution: 4 |
| Fluo-3** | Invitrogen | F3715 | Pipette solution: 0.1 |
| pH | 7.20 | ||
| adjusted with | 1 M KOH | ||
| Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days. | |||
Referências
- Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation. J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).
- Margaret, W. C. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).
- Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).
- Dobrev, D., et al. G-Protein β3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents. Circulation. 102, 692-697 (2000).
- Voigt, N., et al. Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation. Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).
- Voigt, N., et al. Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation. Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).
- Dobrev, D., et al. The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 112, 3697-3706 (2005).
- Voigt, N., et al. Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation. Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).
- Amos, G. J., et al. Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes. J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).
- Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences. Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).
- Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart. Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).
- Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).
- Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart. Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125, 2059-2070 (2012).
- Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart. Circ Res. 26, 679-687 (1970).
- Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method. Life Sci. 33, 1-18 (1983).
- Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
- Bielecki, K. The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart. Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).
- Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure. Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).
- Rich, T. L., Langer, G. A. Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution. Circ. Res. 51, 131-141 (1982).
- Isenberg, G., Klockner, U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a “KB medium”. Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).
- Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes. Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).
- Worthington, K., Worthington, V. . Worthington Enzyme Manual. , (1993).
- Christ, T., et al. Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation. Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).
- Dobrev, D., et al. Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials. Circulation. 104, 2551-2557 (2001).
- Hatem, S. N., et al. Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes. Circ. Res. 80, 345-353 (1997).
- Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance. Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).
- Hove-Madsen, L., et al. Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes. Circulation. 110, 1358-1363 (2004).
- Molina, C. E., et al. Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias. J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).
