Mitochondriën-geassocieerde ER Membranen (eigen MTM) en glycosfingolipiden Verrijkt microdomeinen (GEM): Isolatie van Mouse Brain

Intracellulaire organellen zijn zeer dynamische structuren met verschillende vorm en samenstelling, die onderworpen zijn aan celspecifieke intrinsieke en extrinsieke signalen. De membranen zijn vaak naast elkaar op gedefinieerde contact sites die worden hubs voor de uitwisseling van signaalmoleculen en membranen ^1,2,3,4. De inter-organellen membraan microdomeinen die gevormd tussen het endoplasmatisch reticulum (ER) en de mitochondriën in de opening van de IP3-gevoelige Ca ^{2 +} kanaal staan ​​bekend als de mitochondria bijbehorende ER-membranen of ^4,5,6 eigen MTM. Het eiwit / lipiden en biochemische eigenschappen van deze membraan contactplaatsen zijn uitgebreid bestudeerd met name wat betreft hun rol bij het ​​reguleren van intracellulaire ^{Ca2 + 4,5,6.} De ER dient als de primaire opslag van intracellulaire Ca ^{2 +,} en in die hoedanigheid regelt een groot aantal cellulaire processen stroomafwaarts van Ca ^{2 +} signalering, inclUding post-translationele vouwing van eiwitten en eiwit maturation7. Mitochondria, anderzijds, behouden ^{Ca2 +} homeostase, door buffering cytosolische ^{Ca2 +} concentratie waardoor ze de inleiding van apoptotische routes stroomafwaarts van Ca ^{2 + 4,8} onbalans. Het dynamische karakter van de eigen MTM maakt ze ideaal sites te ontleden elementaire cellulaire mechanismen, met inbegrip van Ca ^{2 +} signalisatie en regulatie van mitochondriale Ca ^{2 +} concentratie, lipide biosynthese en het transport-, energie-metabolisme en celoverleving ^{4,9,10,11,12.} Verschillende protocollen zijn beschreven voor de zuivering van deze microdomeinen van leverweefsel en gekweekte cellen ^13,14.

Eerder gepubliceerde werkwijzen waarbij rekening hebben we een aangepast protocol voor de isolatie van mitochondria en eigen MTM van de volwassen muizenhersenen. Deze procedure hebben we een extra zuiveringsstap, namelijk een Triton X100 extractie, dat enables het isolement van de glycosfingolipiden verrijkte microdomain (GEM) fractie van de eigen MTM. Deze preparaten GEM delen verschillende eiwitcomponenten met caveolae en lipide rafts, afkomstig van het plasmamembraan of andere intracellulaire membranen en voorgesteld om als verzamelen punten voor de clustering van receptor eiwitten en eiwit-eiwit interacties ^4,15.