Vi beskriver metoder för live-cell video mikroskopi av<em> Candida albicans</em> Fagocytos genom makrofager. Dessa metoder möjliggör steg-specifik analys av migration av makrofager, erkännande, omvälvning och fagosomen mognad och avslöja nya aspekter av fagocytos.
Fagocytisk clearance av svamppatogener och mikroorganismer i allmänhet, kan anses bestå av fyra distinkta faser: (i) migrering av fagocyter till den plats där patogener finns, (ii) erkännande av patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) genom mönster erkännande receptorer (PRRS), (iii) omvälvning av mikroorganismer bundna till fagocytsystemet cellmembranet, och (iv) behandling av uppslukade celler i förfallande phagosomes och nedbrytning av intagna partikeln. Studier som utvärderar fagocytos i sin helhet är informativa 1, 2, 3, 4, 5 men är begränsade i att de normalt inte bryta processen ner i migration, omvälvning och fagosomen mognad, som kan påverkas differentiellt. Vidare, sådana studier bedömer upptag som en enda händelse, snarare än som en kontinuerlig dynamisk process. Vi har nyligen utvecklat avancerade levande cell imaging teknik och har kombinerat dessa med genetisk funktionell analys av bådepatogen och värd celler för att skapa ett tvärvetenskapligt plattform för analys av medfödda immunceller funktion och svamp patogenes. Dessa studier har visat nya aspekter av fagocytos som endast kunde observeras med systematisk temporal analys av de molekylära och cellulära interaktioner mellan människor fagocyter och svamppatogener och infektiösa mikroorganismer i allmänhet. Till exempel har vi börjat att definiera följande: (a) komponenterna i cellytan som krävs för varje steg i processen för erkännande, omvälvning och dödande av svampceller 1, 6, 7, 8, (b) hur ytgeometri påverkar effektiviteten i makrofag upptag och dödande av jäst och hyfernas celler 7, och (c) hur omvälvning leder till förändring av cellcykeln och beteende makrofager 9, 10.
I motsats till enstaka ögonblicksbilder tidpunkt, möjliggör levande celler videomikroskopi en mängd olika värdceller och patogener som skall studeras som coen fortlöpande sekvenser över långa tidsperioder, vilket ger rumsliga och tidsmässiga informationen på ett brett spektrum av dynamiska processer, inklusive cellmigration, replikering och vesikulär människohandel. Här beskriver vi i detalj hur du förbereder värd och svampceller, och att genomföra experiment video mikroskopi. Dessa metoder kan ge en användarvänlig guide för framtida studier med andra fagocyter och mikroorganismer.
Här metod för användning av levande celler videomikroskopi att studera makrofag fagocytos beskrivs. Video mikroskopi erbjuder flera ytterligare lager av information för analys. En grundläggande fördel är att upptagnings data kan genereras (från ett enda experiment) för varje tidpunkt under 6 timmar långa observationsperioden. Ännu viktigare, gör den beskrivna metoden differentiell analys av de enskilda stegen i fagocytos. Vi har till exempel visat att förändringar i den totala upptag av C. albicans glykosylering och mutanter morfogenes av linjer makrofagcellinjer och primära makrofager kan antingen vara en följd av förändringar i migration av makrofager mot målceller eller hastigheten av omvälvning gång cell-cell kontakt upprättats 7.
Det finns ett antal fallgropar att undvika när de utför dessa experiment. För det första är det mycket viktigt att säkerställa stabila miljöförhållanden under den experimentella förfaranderande. Detta uppnås bäst i en miljökammare som är inställd på de experimentella betingelserna flera timmar innan börjar experimentet. Video kvalitet är starkt beroende av sofistikerade moduler som använder infraröda lasrar för att automatiskt bibehålla Sample Z-position oavsett mekaniska eller termiska förändringar vilket eliminerar behovet av manuell fokusering korrigeringar.
Med tanke på den förlängda naturen av experimenten, är det viktigt att begränsa exponeringen laserljus och tillhörande fotoblekning och photoconversion effekter, som kan minimeras genom att använda höggradigt fluorescerande markörer, som underlättar låg exponeringstider. FITC färgningsprotokollet beskrivs här är snabb och pålitlig. Eftersom FITC är en mycket ljus och stabil färg, låg exponeringstider krävs och detta gör FITC idealisk för längre tid-lapse-filmer. Emellertid, använder vi rutinmässigt en mängd olika mål fläckar, inklusive kalkofluor vit och PKH färgämnen samt märkta organismer.
<p class = "jove_content"> De flesta av våra publicerade arbetet utförs med ett brett fält mikroskop, men exponering kan minimeras ytterligare genom att använda en roterande skiva konfokalmikroskop och i våra händer detta är viktigt för tidsförlopp 3D-video mikroskopi.Under denna studie bilder tagna med 1 minuters intervall över en 6 timmar fagocytos analys. Intervallet mellan bilderna kan justeras beroende på processen som undersöks. Till exempel kan intervallet minskas vid utredning snabba processer såsom vesikulär människohandel. Den minsta tidsintervallet kommer att begränsas av mikroskop och kamera specifikationer. Det finns några faktorer att tänka på när du justerar tider. Först kommer minska intervallet mellan ögonblicksbilder innebär färre poäng kan avbildas och filstorlek kommer ökas betydligt. Tvärtom kommer att öka bildens intervallet för mycket att göra filmen förlorar kontinuitet.
Detta tillvägagångssätt kan tillämpasi princip att studera andra patogener och upptag av döende värdceller. Till exempel, har vi visat nyligen att benmärg härledda makrofager från sialoadhesin-brist möss kraftigt uppvisar reducerad bindning och fagocytos av sialylerade Campylobacter jejuni 8. Dock är målstorlek en viktig faktor för genomförbarhet, eftersom bildanalys blir allt svårare med en minskning av målcell storlek. Sofistikerad bildanalys programvara är avgörande för snabb video mikroskopi analys och detta bör kombineras med lämpliga bioinformatik stöd för att underlätta generering av algoritmer för att studera migration av enskilda celler och hela cellpopulationer 7. Live-cell video mikroskopi i kombination med sofistikerad bildanalys programvara för minut-för-minut analys av migration och individuella makrofag-C. albicans interaktioner ger en unik inblick i komplexiteten i C. albicans fagocytos genom macrophages. Det finns en enorm potential att utvidga dessa metoder för att studera andra patogener och fagocyter (dendritiska celler, neutrofiler) och att utveckla 3D-video mikroskopi på bilden cell-cell interaktioner i närmare eller på mer fysiologiska ytor såsom epitel-och endotelceller lager. Denna teknik är en del av nästa generations verktyg i studiet av värd-patogen interaktioner och bidra till att skapa detaljerade geografiska och tidsmässiga information om ett brett spektrum av dynamiska processer.
The authors have nothing to disclose.
LPE är en skotsk Senior Clinical Fellow och erkänner stöd av Chief Scientist kontoret (SCD/03). Detta arbete har finansierats av Wellcome Trust Project Bidrag till LPE (089.930). NARG finansierades genom en Wellcome Trust program Grant (080.088) och en utrustning (075.470) (för DeltaVision), och av en FP7-2007-2013 Grant (HEALTH-F2-2010 till 260.338-Allfun). Vi vill tacka universitetet i Aberdeen imaging anläggning, i synnerhet Kevin MacKenzie, för hjälp stöd och råd.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 |
NaOH | Sigma | S5881-500G |
Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G |
Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 |
D-glucose | Sigma | G7021-1KG |
SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 |
FITC | Sigma | F7250-1G |
Sodium carbonate | BDH | 301215M |
Sodium bicarbonate | BDH | 102475W |
PBS | Gibco | 18912-014 |
DMEM | Lonza | BE12-614F |
FCS | Life Technologies | 10106169 |
Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 |
L-glutamine | Lonza | BE17-605E |
LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 |
35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |