Summary

Mærkning af enkeltceller i centralnervesystemet hos<em> Drosophila melanogaster</em

Published: March 04, 2013
doi:

Summary

Vi præsenterer en teknik til mærkning af enkelte neuroner i centralnervesystemet (CNS) af<em> Drosophila</em> Embryoner, som giver analyse af neuronal morfologi ved enten lystransmission eller konfokal mikroskopi.

Abstract

I denne artikel beskriver vi, hvordan du individuelt mærke neuroner i de embryonale CNS af Drosophila melanogaster ved juxtacellular injektion af lipofile fluorescerende membran markør Dil. Denne metode gør det muligt visualisering af neuronal cellemorfologi i stor detalje. Det er muligt at mærke en celle i centralnervesystemet: cellelegemer af mål-neuroner er visualiseret under DIC optik eller ved ekspression af en fluorescerende genetisk markør, såsom GFP. Efter mærkning, kan Dil blive omdannet til en permanent brun plet ved fotoomdannelse at tillade visualisering af cellemorfologi med transmitteret lys og DIC optik. Alternativt kan Dil-mærkede celler observeres direkte med konfokal mikroskopi, hvilket muliggør genetisk indført fluorescerende reporter-proteiner, der skal colocalised. Teknikken kan anvendes i noget dyr uanset genotype, hvilket gør det muligt at analysere mutante fænotyper ved enkeltcelle-opløsning.

Introduction

Kendskab til neuronal morfologi på de enkelte celler er en vigtig forudsætning for at forstå neuronal tilslutningsmuligheder og CNS-funktion. Således fra de tidligste dage af neurovidenskab, har forskere forsøgt at udvikle encellede mærkningsteknikker (se 7 for en historisk behandling af dette spørgsmål). Klassiske metoder, såsom Golgi-farvning giver fremragende opløsning af neuronal morfologi, men er ikke egnet, hvis man søger at mærke en bestemt type neuron i en rettet måde, som forekommer farvning på en tilfældig måde. Udviklingen af ​​metoder til farvning enkelte celler ved intracellulær eller juxtacellular injektion af farvestoffer fra en mikroelektrode rettet kravet om særlig mærkning.

Anvendelsen af en enkelt neuron farvestof injektion til Drosophila præsenterede en stor udfordring på grund af den lille størrelse af både organismen og dens neuroner. Ikke desto mindre enkelt neuron farvning af embryonisk Drosophila </em> Neuroner blev opnået i midten af 1980'erne i laboratoriet af Corey Goodman 15. Mens metode har været særdeles nyttigt og har givet nogle vigtige indsigter i mekanismer til neuronal udvikling i Drosophila i løbet af de sidste 20-30 år (f.eks 2, 10), har mange arbejdere veget tilbage fra det, hovedsagelig på grund af dets tekniske krav.

Tilgængeligheden i de senere år af genetiske teknikker til neuronal mærkning i Drosophila har også bidraget til upopulær enkelt neuron farvestof injektion. GAL4-rettet ekspression af membran-målrettet GFP-konstruktioner kan give fremragende opløsning af neural morfologi 1, 20. Imidlertid har denne fremgangsmåde visse begrænsninger: den ofte uundgåelige ekspression af GFP i flere celler kan tilsløre strukturen af ​​individuelle neuroner og et GAL4 transmissionsledningen er muligvis ikke tilgængelig til at drive ekspression i en bestemt neuron af interesse. Den MARCM (Mosaic Analysis med et Repressible cellemarkør) metode 8 kan tilvejebringe mærkning af væsentlige enhver neuron på det individuelle celleniveau, men ikke med held anvendt i embryoet og tidlig larve på grund af den langsomme omsætning GAL80-proteinet.

I betragtning af disse begrænsninger af genetisk mærkning, mener vi, at en enkelt neuron farvestof indsprøjtning i Drosophila foster forbliver en værdifuld teknik og fortjener bredere anvendelse. For at fremme dette mål, vi giver her en detaljeret beskrivelse af metoden. En illustration af sin magt er leveret af vores nylige hensyn til morfologi af det komplette sæt interneuroner i abdominale neuromeres i slutningen af Drosophila foster 14. Denne undersøgelse, som afslørede både morfologisk variation af individuelle neuronale celletyper og principperne for neuromere organisation i centralnervesystemet hos fosteret, ville ikke have været muligt med andre foreliggende mærkningsmetode.

Protocol

Vi har brugt to lidt forskellige varianter af den enkelte neuron mærkningsmetode i vores laboratorier. Forskellene vedrører embryonindsamlingsteam, dechorionisation, devitellinisation og embryo filetering trin. Figur 1 giver en oversigt over de fælles og divergerende trin varianterne. 1. Fremstilling af mikro-kanyler til Embryo Dissektion og Mikropipetter for Dye Injection Glas nåle til embryo dissektion er hentet fra glaskapillarer (1 mm i diameter og 0,1 mm …

Representative Results

4 viser typiske resultater af teknikken, er beskrevet her. 4A viser et eksempel på en Dil fyldt enkelt interneuron der var rent photoconverted. Det pænt viser mængden af ​​detaljer disse præparater tilbud. Når de betragtes under DIC optik den rumlige sammenhæng af det mærkede celle i det ikke-mærkede omgivende væv bliver synlig, fx positionen af cellelegemet i cortex og af fiberen fremspring i neuropile. Figur 4B er et …

Discussion

En væsentlig fordel ved Drosophila som et modelsystem er, at den tillader analyse af udvikling og funktion af niveauet af enkeltceller. Dette er især nyttigt i forbindelse med nervesystemet, hvor de forskellige celletyper er usædvanlig høj og funktionen og morfologi af naboceller kan være helt forskellige.

Fremgangsmåden præsenteres her tillader mærkning af individuelle neuroner med et farvestof, som enten kan omdannes til en permanent farvning eller undersøges direkte ved …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra DFG til GMT

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
      REAGENTS
DAB Sigma-Aldrich D-5905 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI Invitrogen/Molecular Probes D-282 1 mg/ml in ethanol
Formaldehyde Merck Millipore   7,4 % in PBS
Glycerol Roth 3783 70% in PBS
Heptane Glue Beiersdorf AG Cello 31-39-30 * dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane
PBS     1x
TRIS Roth 4855  
Vectashield Vector Laboratories H1000  
      EQUIPMENT
Confocal Microscope Leica TCS SP2 to view and document labelings in fluorescence
DC – amplifier Dragan Corporation Cornerstone ION-100 to perform the labelings
Coverslips Menzel BB018018A1 18 x 18 mm
Coverslips Menzel BB024060A1 24 x 60 mm
Dissecting Microscope Leica MZ8 to prepare and disect embryos
Flat Capillaries Hilgenberg   outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm
Injection Capillaries Science Products GB 100 TF 8P  
Micromanipulator R Leica   to perform the labelings
Model P-97 Sutter Instruments   to pull capillaries
Object Slides Marienfeld Superior 1000000  
Scientific Microscope Zeiss Axioskop 2 mot to view labelings after photoconversion
Scientific Microscope Olympus BX50 to perform the labelings
Sony MC3255 Video Camera Sony/AVT Horn Sony MC3255 to record labelings after photoconversion

Table 1.

Referências

  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  2. Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron. Dev. Suppl. , 227-238 (1993).
  3. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. . The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , (1985).
  4. Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).
  5. Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67, 45-57 (1991).
  6. Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages. Development. 139, 2510-2522 (2012).
  7. Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
  8. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  9. Levick, W. R. Another tungsten microelectrode. Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).
  10. Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations. Cell. 81, 631-639 (1995).
  11. Murray, M. J., Whitington, P. M. Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile. Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).
  12. Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron. J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).
  13. Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
  14. Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).
  15. Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development. Nature. 310, 203-207 (1984).
  16. Whitington, P., Harris, K. Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata. Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).
  17. Whitington, P., Meier, T. Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt). Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).
  18. Whitington, P. M., Seifert, E. Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery. Biologia do Desenvolvimento. 106, 438-449 (1984).
  19. Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans. Development. 118, 449-461 (1993).
  20. Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).
check_url/pt/50150?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Rickert, C., Kunz, T., Harris, K., Whitington, P., Technau, G. Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (73), e50150, doi:10.3791/50150 (2013).

View Video