In vivo to-foton billedbehandling af oplevelsesbaseret afhængige molekylære ændringer i kortikal neuroner

De eksperimentelle procedurer, der beskrives nedenfor, blev godkendt af National Institute of Mental Health Animal Care og brug Udvalg og var i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr.

1. Pre-operative Preparation

1. Rengør alle redskaber i en varm perle sterilisator før aseptisk kirurgi, rense operationsstedet med 70% ethanol, og satte rene drop klude. Bær sterile handsker. Bedøve dyret med frisk fremstillet 1,2% Avertin opløsning, givet ved 0,02 ml / g, intraperitonially. Alternativt kan bedøve med isofluran gas gennem en næse kegle, 5% til induktion, 1,5% for vedligeholdelse, med en passiv ådselæder kredsløb. Kontroller anæstesi niveau med hale eller tå klemmer til at sikre fuld sedation.
2. Dækker dyrets øjne med steril ophthalmisk salve, og injicere frisklavet dexamethason (0,2 mg / kg) og carprofen (5 mg / kg) subcutaneously for at forhindre hjernen hævelse og inflammation ^11. Barbere håret over kraniet mellem ørerne, og sterilisere huden med betadin krat og tre alternerende svabere på 70% ethanol.
3. Montere dyr i en stereotaksisk kirurgi fase med earbars, med en vandcirkulation varmepude under dyret indstillet ved 37 ° C. Kontrollér regelmæssigt dyrets anæstesi niveauer, og supplerer det originale bedøvelsesmiddel dosis efter behov.
4. Injicer 200 gl 0,5% marcain under hovedbunden huden at dulme området. Incise huden og fjerne huden flap over kraniet. Fjern periosteum og tørre området med rene vatpinde.

2. Kronisk Cranial Window Kirurgi

1. Brug et high-speed tandlægebor med en 0,5 mm burr til forsigtigt at skitsere en 3-5 mm cirkel med en diameter over hjernen regionen af ​​interesse. Periodisk væde borestedet med sterilt 0,9% saltvand og klar væk knogle støv med rene vatpinde. Hvis knoglen blødninger, skal du bruge gelfoam forgennemvædet med sterilt saltvand for at udslette de bløder og vente på det til at stoppe.
2. Når den sidste knogle lag er nået, løft og fjern knogle ø med fin spids tang. Dura vedhæftede filer til nederste hylde af knoglen kan opstå, hvis vinduet krydser en knogle sutur. Disse skal fjernes forsigtigt, da knoglen klap løftes.
3. Roll fugtet gel skum forsigtigt over den blottede dura at rense dens overflade og vente på nogen dural blødning til at stoppe Kritisk trin:. Ikke fortsætte, indtil alle dural blødningen er stoppet. Blod, der bliver fanget inde i kranielle vindue fører som regel til en uigennemsigtig vindue.
4. Hvis området af interesse er under et sted, hvor dura er særlig tyk, fjernelse af dura ovenfor kan det være nødvendigt. Hvis dette er tilfældet, forsigtigt adskille dura fra pia nedenfor med meget fine tænger, lave et lille snit i løftet dura med et andet par af fine tænger, derefter fat, hvis kanter og blidtopdele dura. Det dura er tynd, men stærk, så pas på ikke at skære i hjernen med de intakte kanter dura.
5. Skyl området med en steril ACSF eller sterilt saltvand.
6. Lægge et sterilt dækglas (3-5 mm) i forhold til dura eller pia kritisk trin:. Hvis de omgivende kranium kurver betydeligt, anvendes Kwiksil ¹² klæbemiddel for at udfylde rum, hvor dura mater eller pia ikke gør tæt kontakt med dækglasset i regioner der vil ikke blive afbildet.
7. Brug cyanoacrylat gel til at dække det elastomere klæbemiddel, og kanten af ​​dækglas. Dæk hele udsatte kraniet med cyanoacrylat gel, eller en krazyglue og dental cement blanding Kritisk trin:. Lad ikke nogen cyanoakrylat gel at røre hjernen overflade.
8. Integrere en skræddersyet metal hoved fiksering bar i den modsatte ende af kraniet.
9. Sende dyret til et varmt recovery kammer, efter en intraperitonial injektion af ketoprofen, 5 mg / kg, for smertebehandling. Fortsætte analgetikum til to dage postoperativt.
10. Efter to ugers postoperativ restitutionstid, dyret bedøver med isofluran (5% for induktion, 1,5% til vedligeholdelse), montere det i en skræddersyet mikroskop scenen med et hoved-fiksering stel, og tjek den kraniale vindue for optisk klarhed under belysning med blåt lys. Brain overflade blodkar klarhed er yderst indikerer cranial window kvalitet. Hvis blodkar kanter skarpt defineret, vinduet sandsynligvis være anvendelige. Den to uger postoperativ restitutionstid anbefales at give tilstrækkelig tid til dyret kan komme fra kirurgi. Kranielle vinduer typisk rydde og forbedre i løbet af denne tid, og forblive optisk transparent for ekstra uger til måneder indtil genvækst af kraniet eller fortykkelse af dura forringer vinduet kvalitet.

3. Behavioral protokol og Laser Scanning to-foton mikroskopi

1. Dyr med tydelig cranial vinduer vil blive udsat for en miljømæssig stimulus eller underkastes en adfærdsmæssig træning og derefter afbildes derefter på tidspunktet for maksimal Arc-GFP-ekspression. Inden du begynder en adfærdsmæssig protokol, bør dyret holdes i en sammenhængende hjem bur miljø for at minimere dag-til-dag variation i baseline Arc-GFP ekspressionsniveauer.
2. Begynd adfærdstræning eller miljømæssige stimulation paradigmer, afhængigt af hjernen regionen af ​​interesse. For eksempel kan dyr udsat for forskellige visuelle miljøer i hinanden følgende dage, og afbildes hver dag efter visuel stimulation at identificere stimulus-specifikke responser i den visuelle cortex ^10.
3. Arc-GFP-fluorescens i neuroner typisk når sit højeste niveau to timer efter stimulering. Den eksperimentelle tidslinie kan optimeres for at lette påvisningen af ​​Arc-GFP-ekspression i neuroner på deres højdepunkt niveauer af fluorescens.
4. Efter en adfærdsmæssig træning eller environmental stimulation er afsluttet, bedøve dyret med isofluran (5% til induktion, 1,5% vedligeholdelse) og montere dyret i skræddersyede objektbordet med hoved-fiksering ramme under to-foton mikroskop.
5. Dyrets hoved position er fastgjort til hoved-fiksering ramme, der forbinder direkte til scenen, ved hjælp af implanterede metal bar på kraniet. Isofluran og oxygen kontinuerligt til musen gennem en næsekegle. Kropstemperaturen opretholdes ved anvendelse af en varmepude.
6. Sikre, at mikroskop detektorer er beskyttet mod omgivende lys gennem to-foton laserscanning i et mørkt rum. Brug en 20x eller 25x (1,05 blændetal) nedsænkning i vand linse til billeddannelse. Først under epi-fluorescens belysning erhverve et billede af overfladen blodkar mønstre i hjernen regionen af ​​interesse med et CCD-kamera til fremtidig billedjustering.
7. Start to-foton laserscanning at erhverve et 3-D billede stakken. Et Olympus FV1000MPE multi-fotone mikroskop anvendes i vores setup. Det exciterende bølge-længde af to-foton laser er indstillet til 920 nm, og laserens udsendes fra målet er sat til omkring 50 mW. Udsendte fluorescens samtidig detekteret i grønne og røde kanaler (dikroisk spejl ved 570 nm, barrierefiltre ved 495-540 nm og 570-625 nm) under anvendelse af et eksternt to-kanals photomutiplier detection system anbringes i nærheden af ​​prøveemnet. Arc-GFP-fluorescens vises kun i den grønne kanal, hvorimod væv auto-fluorescens vises i både kanalerne ^{13, 14.}
8. Typiske billedstakke har dimensioner på ca 320x320x100 um (bredde x længde x dybde), en horisontal opløsning på 0,5 um / pixel, og en vertikal opløsning på 3 um / pixel.
9. Efter modtagelsen af ​​billedet stakken, sende dyret tilbage til sit hjem bur. Forstyr ikke dyret indtil næste adfærdsmæssige og imaging session. Gentag adfærd og billedbehandling procedure tværs dage som ønskeligted. Brug den tidligere erhvervede hjerne overflade blodkar billede at orientere tilbage til det samme imaging placering.

Denne protokol beskrives en metode til at følge erfaringer-afhængige molekylære ændringer i de enkelte corticale neuroner i levende dyr. En kronisk kraniale vindue først skabt over en kortikale region af interesse i en mus, der bærer en fluorescerende reporter for genekspression. To-foton mikroskopi kan derefter kobles med forskellige adfærdsmæssige paradigmer at observere behaviorally inducerede molekylære ændringer i individuelle neuroner og spore de ændringer i de samme sæt af neuroner over flere dage (figur 1).

I Arc-GFP-mus, kan erfaring-afhængige ændringer i Arc genekspression pålideligt afbildes i individuelle kortikale neuroner for flere dage ved hjælp af denne protokol. Den transgene Arc-GFP knock-in mus udtrykker en destabiliseret grønt fluorescerende protein (d2EGFP, protein-halveringstid cirka to timer) under kontrol af den endogene promotor af det umiddelbare tidlige gen Arc (figur 2).

Efter inddrivelsen fra kranial vindue kirurgi er dyr monteret i en custom-made hoved-fiksering ramme og scene. Figur 3 viser headbar og hoved-fiksering anvendte ramme i løbet af to-foton billedbehandling. Opretholdelse af en ensartet to-foton mikroskop imaging trins position og opstilling vil lette dag-til-dag tilpasning af billeder, når de vender tilbage til en tidligere afbildet område af hjernen, og øger eksperimentelle effektivitet, når flere dyr afbildet på den samme dag (Figur 4).

Under adfærdsmæssige uddannelse eller miljømæssig stimulering, er det tilrådeligttil at huse dyr enkeltvis, og på en miljømæssigt konsekvent hjem bur placering, minimere til dag-til-dag udsving i baggrunden Arc-GFP aktivering niveauer (Figur 1).

En kritisk tegn på en stabil, klar kraniel vindue er sprød mønster af blodkar under epi-fluorescerende belysning. Denne blodkar mønster bør ikke ændre sig væsentligt på tværs af flere dage med billeddannelse (fig. 5).

Figur 6 illustrerer ekspressionsmønstre for Arc-GFP i frontal corticale neuroner under baseline hjembur tilstand (A) og efter udførelse af en ny motorisk adfærd (B). Layer II / III corticale neuroner i samme hjerneregion i det samme dyr pålideligt kan afbildes, og de samme neuroner bør kunne identificeres over flere dage billeddannelse. Det er typisk at indsamle et 3-D billede stakken til prøve hundredvis af neuroner. Neuron kanter skal være skarpe og klare hele billedet stack. Tissue auto-fluorescens i den røde kanal giver også et indeks af vinduet klarhed. Hvis det afbildede område bliver drastisk murkier over dage, er kraniel vindue kvalitet sandsynligvis forværret. En typisk kraniale vindue forbliver optisk klar i mindst en uge. Efter adskillige uger til måneder, vil genvækst af kraniet fra kanten af ​​den kraniale vindue og fortykkelse af dura sidst forhindre yderligere billeddannende eksperimenter.

Figur 1. Et skema skitserer de eksperimentelle trin. Under Animal forberedelsesfasen, er craniale vindue operationer udført på Arc-GFP mus. Dyrene er givet omkring to uger at komme sig efter operationen i deres eget bur. Klarheden af ​​den kranielle vinduer kontrolleres derefter med epi-fluorescensmikroskopi. Hvis vinduerne er klar til billeddannelse, dyrene enkeltvis opstaldet i et roligt, miljømæssigt konsekventhjembur miljø, hvorfra Experimental Tidslinje fase kan begynde. Den adfærdsmæssige stimulation protokol og den billeddannende interval kan tilpasses til at detektere Arc-GFP på sit højeste fluorescens, der typisk forekommer to timer efter aktivering. Efter den adfærdsmæssige stimulation er fuldført, er dyret bedøvet, og den kortikale region af interesse afbildes gennem den kraniale vindue ved hjælp af to-foton mikroskopi. Dyret returneres derefter til for burene. De adfærdsmæssige og billeddannelse sessioner kan gentages på tværs af dage, som ønskes.

Figur 2. Et diagram, der viser konstruktionen af Arc-GFP knock-in muse line, et gen kodende hvor destabiliseret grønt fluorescerende protein erstattet den kodende del af det umiddelbare tidlige gen Arc. I denne stamme af mus, er GFP-ekspression under kontrol af den endogene Arc promotoren. Dette diagram gentegnes baseret påbeskrivelsen i referenceeksempel 10.

Figur 3. Skematisk og dimensioner af hovedet-fiksering opsætning der anvendes til to-foton-billeddannelse. Den faste halvdel af headbar er limet til bagsiden af ​​kraniet (afsnit 2.8), og enden med skruen hul anvendes til at fastgøre bedøvede dyrets hoved til rammen. Hoved-fiksering ramme består af en tynd metalplade monteret oven to poler med skruer.

Figur 4. Eksempel på en laserscanning to-foton mikroskop setup for Arc-GFP mus billeddannelse. Bemærk 25x nedsænkning i vand linse, varmepude og brugerdefinerede mikroskop scenen med et hoved-fiksering ramme. Den bedøvede Arc-GFP-mus vist her er klar til in vivo-billeddannelse.

Figur 5. Billeder af hjernens overflade blodkar i et kronisk kranie vindue over flere dage, viser den klarhed og stabilitet af blodkar mønstre over tid. Brain overflade blev belyst med blåt lys, og billederne blev taget gennem et 25x vand-nedsænkning linse med et CCD-kamera monteret på mikroskopet.

Fig. 6. In vivo to-foton billeder af Arc-GFP-ekspressionsmønstre i frontale kortikale neuroner i en mus efter to forskellige adfærdsmæssige oplevelser. (A) Den mus forblev i sit eget bur før billeddannelsen på den første dag. (B) Musen udførte en ny motor adfærd før billedbehandling på andendagen. Fluorescerende billeder af den samme kortikale region blev samtidigt opnået i grønne og røde kanaler. GFP-fluorescens kun dukkede op i den grønne kanal, mens væv autofluorescens optrådte i begge kanaler. Detection parametre blev indstillet således, at væv auto-niveauer af fluorescens i både røde og grønne kanaler havde lige store aflæsninger, og disse parametre blev opretholdt gennem eksperimenter. Den røde kanalsignal blev derefter subtraheret fra den grønne kanal signal til fjernelse bredbånds-væv autofluorescens under off-line-analyse. De resulterende grønne fluorescerende signaler fra en 18 um tyk 3-D billedstak blev projiceret fra højeste intensitet til det vandrette plan, for at tilvejebringe en oppefra af de cellulære mønstre af Arc-GFP-ekspression. Scale bar, 30 um.

Den in vivo-billeddannelse her beskrevne fremgangsmåde muliggør gentagen undersøgelse af Arc genekspression ændringer i de samme sæt af neuroner over flere dage i det levende dyr. Det er en effektiv og alsidig metode til at indhente oplysninger om neurale plasticitet-relaterede molekylære dynamik i de enkelte neuroner som reaktion på forskellige adfærdsmæssige oplevelser. Standard histokemiske metoder, såsom in situ-hybridisering og immunfarvning kan opnå enkeltcelle-opløsning ^3, men mangler evnen til at spore genekspression ændringer i de samme neuroner over flere dage. Bioluminescens, resonans, eller nukleare afbildningsmetoder kan spore genekspression ændringer i det samme dyr ved hjælp af passende reportere ^15, men mangler den rumlige opløsning for at adskille de ekspressionsniveauer i individuelle neuroner. Som sådan kan ingen andre eksisterende metoder til måling af genekspression ændringer matcher både den rumlige opløsning og den tidslige covgennemsnittet af den billeddannende her beskrevne fremgangsmåde.

Et afgørende skridt i denne procedure er den kranielle vindue kirurgi. Det bør udføres med ekstra omhu for at undgå traumer til hjernen eller forlader blod under dækglas, hvilket vil forårsage betændelse og reducere klarheden af ​​kranie vinduer. For velgennemførte craniale operationer, vil vinduet forblive klar i flere uger indtil fortykkelse af dura eller genvækst af kraniet fra kanten af ​​vinduet forhindre yderligere billeddannelse. Dura mater kan fjernes om nødvendigt, som det er sket for kroniske optisk billeddannelse eksperimenter i rotter og aber ^16,17, for at øge den optiske klarhed af kranie vinduer.

En begrænsning for den to-foton mikroskopi teknik, der anvendes i denne protokol er det billeddannende dybde. Den maksimale imaging dybde, hvor billeder i høj kvalitet kan opnås, vil afhænge af den kranielle vindue klarhed, mikroskopet opsætning, og lysstyrken af ​​fluoresc skellige reportere. For Arc-GFP-mus, vi typisk billede op til 300 um under pial overflade. At undersøge genekspression ændringer i dybe områder af hjernen, kan fluorescens microendoscopy anvendes til at overvinde dybden begrænsning i konventionelle to-foton mikroskopi ^18.

Potentielle forstyrrende faktorer til genekspression ændringer bestemt med dette in vivo billeddannelse metode omfatter eventuelle tiloversblevne effekter fra kranial operation eller bedøvelse, som kan interferere med adfærdsmæssige ydeevne eller induktionen af Arc-GFP. Det er vigtigt at kontrollere det samlede omfang af Arc-GFP aktivering som svar på specifikke oplevelser i faste hjernesnit først, og sammenligne denne i det omfang, observeret ved gentagne billeddannelse ved hjælp af in vivo to-foton mikroskopi. Den postoperative rekonvalescensperiode og de gentagne imaging intervaller kan derefter justeres for at minimere de potentielle bivirkninger ved kirurgi og anæstesi på Arc-GFP-aktivering.