ショウジョウバエアダルト嗅覚ショックラーニング

1。フライの準備遺伝的背景26をコントロールするために行動実験の前に少なくとも6つの世代のために、全ての変異体、GAL4 / UASなどCSw-などの野生株と他の行を、異系交配。 具体的な操作が異なる温度を必要としない限り、25℃で12時12分時間の明暗サイクル下で標準的なコーンミール、酵母および糖蜜食品食のハエを育てる。 開発を通じたGal4 GAL80 TS（ターゲットシステム）に導入遺伝子の発現を防止した後、1〜2日間の行動実験の前に30℃のインキュベーターにハエを移動するために使用し、18℃：導入遺伝子発現の効果を判定すること。導入遺伝子発現3,4,6,7,14の効果を決定するために、30℃で実験を行う。 神経細胞を刺激するために、熱活性化TRPA1チャネルを用いた実験の場合：既知の温度である23℃、でハエを上げる非アクティブなチャネルを維持し、その後発現ニューロン、TRPA1を活性化するために、30℃で行動室に移行する。 18℃でリアハエし、30℃でテストを実施：シナプス出力11、14,24をブロックする敏感 Shibire 温度を用いて実験のため。 1〜2日後、実験前にハエを集め、光、CO 2麻酔下で、約25のグループでそれらを数える。 （具体的な操作が異なる温度を必要とした場合を除く）、25℃で（酵母なしで）食品用バイアル中にハエ少なくともO / Nを格納し、午前12時12時間の明を持つ環境的に制御された部屋の中で70％の相対湿度：暗い時まで実験の。 注：このストレージは、ハエがショウジョウバエの学習のための最適な条件を持っていた環境制御されたクリーンルームで行うその後の学習テストに順応することを可能にし、重要なのは、どんな毎日ENVIを削除します行動的表現型に影響した可能性があり境バリエーション。 実験前2。準備カスタムメイドのパースペックスT-迷路における実験（ 図1）を実行します。 定期的に気密シールが実験中に得られることを保証するために、管継手をご確認ください。必要であれば、T-迷路の内側コンパートメントをシール、Oリングを変更してください。 トレーニングチューブの内側にカスタムメイドの銅グリッドを配置します。確認し、定期的にこれらのグリッドをきれいにし、酸化された場合には交換してください。電気刺激装置に接続されたスイッチボックスに実行するワニ口クリップを介して、配線に銅グリッドを取り付けます。装置が必要なショックを配信していることを保証するために電圧計を使用してください。 どんな空気漏れを避けるために、しっかりと迷路を保持するために、G-クランプを使用してください。 匂いがハエを越え引かれ、その後、T-迷路から削除されるように、空気ポンプを結ぶ配管に、T-迷路を取り付けます。穏やかな空気を維持〜2リットル/分で流し 3臭気希釈液ハエは両方の臭いに対して等しい優先性を示すことがこのような濃度で二つの異なる匂いを使用してください。鉱物油7,13で希釈した：（100 1）4 -メチルシクロヘキサノール（1:67）、および3-オクタノールを使用してください。 注：慎重に研究室によって異なりますこれらの濃度を決定する。例えば他の人は、両方の匂い24 1:10を使用しています。他の一般的に使用される悪臭を酢酸エチルおよびイソ – アミルアセテートが挙げられる。 ピペットこうして臭気プルームにハエを暴露、空気がカップに臭い上に描画することを可能にする有孔上部とプラスチックチューブで覆われた臭気ブロックに入り、カスタムメイドの匂いカップに希釈された臭気を30μl。 4訓練プロトコル（図1および2） 大人の嗅覚衝撃コンディショニングのために、暗赤色灯の下ですべての実験（ すなわち 、赤色LED）、研究者は見ることができます実行しますが、FLを防ぐこのように視覚的な入力とは対照的に、ハエは嗅覚に集中することができ、見てからのy。 トレーニングチューブにハエを導入してから、T-迷路にアタッチし、それらを90秒間チューブと空気の流れに適応することができます。 60秒の合計持続時間（3.75秒パルス間間隔で12 1.25秒のパルスからなる）60-Vのショックで最初の匂い（4 – メチルシクロヘキ、MCH）を提示。 匂いやショックなしに30秒の休止期間とショックに従ってください。 ショックのない60秒間二臭（3 – オクタノール、OCT）を提示。 匂いやショックなしに30秒の休止期間とショックに従ってください。 その側にT-迷路を回し、ゆっくりとそのような古いマウスマットなどの柔らかい物の上のT-迷路の底部を強打することにより、T-迷路の中央チャンバー内にトレーニング室からハエを移動します。 90秒間中央室にハエを維持します。 BOへの選択肢チューブを取り付け装置のttomは、T-迷路を形成する。 学習を測定するために、それらは同時に匂いに暴露し、1に向かって移動し、T-迷路、選択ポイントにハエを移動します。 120秒間の試験期間を実施する。 それによって選択肢管の端部を遮断する中央チャンバを上にスライドさせてトラップの選択管内でハエ。食品バイアルに、T-迷路の各アームと中央コンパートメント内のハエを収集し、カウントされます。 、メモリを測定する訓練（4.6）の後にハエを収集し、酵母なしで食料バイアルに、T-迷路からそれらを転送するには。ストア（導入を参照）、25℃で暗く、興味のあるメモリ位相を決定するのに必要な残りの時間、70％の湿度に飛ぶ。ステージ4.7のように、T-迷路にハエを再導入。 長期記憶のために、ハエのいくつかのバッチを同時に訓練することができるカスタム構築された迷路を使用しています。 15分間のサイクル間隔（スパと訓練の5サイクルの管理CED）またはインターサイクル間隔なしで（密集）。試験まで、暗所で18℃、ハエおよび70％の湿度を維持します。試験の前に、25℃にハエを移動し、それらが少なくとも1時間順応することができます。訓練の後、長期記憶の24時間を評価する。 行動実験の後、お湯と洗剤で無臭臭いカップを清掃してください。乾燥後、10μlのシグマコートでコートカップを。電子レンジで加熱することにより、シグマコートを乾燥させる。時折お湯と洗剤で無臭のT-迷路パースペックス管や臭気ブロックを清掃してください。 性能指数の5。計算：ハエ '記憶の測定マイナスハエ（CSの総数で割った衝撃対に匂い（CS +）を選択するハエの数-ショックペア匂い（CS）を回避ハエの数などの条件ごとに性能指数（PI）を計算する- + CS +）1。 ペーrformance指数（PI）=（＃CS -ハエ- ＃CS +が飛ぶ）/（＃合計ハエ） MCHはショックペア臭いと10月には衝撃ペア臭いだったものであった実験のPIを平均化することによって、実験の最終PIを計算します。これは、1つの臭いのために、より高い優先順位を持つハエのいずれかのバイアスを除去。 6。感覚コントロール T-迷路6,7,17 ​​へ〜40-50ハエを導入することにより、臭気視力を実行します。 90秒後に、選択点にハエを移動し、純粋な匂いと空気のどちらかを選択する彼らに2分を可能にします。 ハエを収集し、カウントされます。試験に参加したものによって臭気を選んだハエの合計数を割ることによって回避率を計算します。 ショック反応性6,7,17 ​​の場合、ショックチャンバーにハエを導入。 残りの90秒後に、ハエが同様に逃げることができる、そこから60-V D​​C電気ショックを、管理するショックのないチューブ。 ハエが選択するための2分を許可する。ハエを収集し、カウントされます。実験でのハエの総数で衝撃波管をエスケープすることで衝撃を避けハエの数を割ることによって衝撃回避率を計算します。電気ショックを免れたものを合計で中央室に残ってハエを含めます。