Передний мозг Электрофизиологические записи в личинки данио рерио
Summary
Простой метод для записи внеклеточных потенциалов поля в личиночной рыбок данио мозга описаны. Метод обеспечивает надежную<em> В естественных условиях</em> Чтение из захвата-подобную активность. Эта техника может быть использована с генетически модифицированными данио личинки проведения эпилепсии генов, связанных или судороги вызваны администрации судорожного наркотиков.
Abstract
Эпилепсия затрагивает почти 3 миллиона человек в Соединенных Штатах и до 50 миллионов человек по всему миру. Определяется как возникновение спонтанной неспровоцированных припадков, эпилепсии могут быть приобретены в результате оскорбления в мозг или генетической мутации. Усилия по модели припадки у животных в первую очередь использовать приобретенные оскорбления (судорожного наркотики, стимуляцию или черепно-мозговой травмы) и генетических манипуляций (антисмысловой нокдаун, гомологичной рекомбинации или трансгенез) у грызунов. Данио рерио является моделью системы позвоночных 1-3, которые могут предоставить ценную альтернативу грызунов на основе исследования эпилепсии. Данио рерио широко используются в исследовании позвоночных генетики или развития, проявляют высокую степень генетического сходства с млекопитающими и выразить гомологов для ~ 85% известных человеческих одной мутации гена эпилепсии. Из-за своих небольших размеров (4-6 мм в длину), личинки данио рерио могут быть сохранены в объемах жидкости столь же низко как 100 мкл во время раннего развития и ARRAрый в мульти-луночных планшетах. Реагенты могут быть добавлены непосредственно в раствор, в котором развиваются эмбрионы, упрощения введения препарата и позволяет быстро в естественных условиях скрининга тестируемых соединений 4. Синтетические олигонуклеотиды (morpholinos), мутагенеза, цинкового пальца нуклеазы и трансгенных подходов может быть использован для быстрого создания нокдаун гена или мутации у рыбок данио 5-7. Эти свойства позволить себе рыбок данио исследования беспрецедентными статистического анализа преимуществ власть над грызунами в изучении неврологических расстройств, таких как эпилепсия. Потому что «золотым стандартом» для лечения эпилепсии исследований является мониторинг и анализ аномальных электрических разрядов, которые происходят в центральной структуры мозга (например, эпилептические припадки), метод эффективного записи активности мозга в личиночной рыбок данио описано здесь. Этот метод адаптации обычных внеклеточной методы записи и позволяет стабильный долгосрочный мониторинг активности мозга в неповрежденный личинки данио рерио. Sдостаточное записи показаны для острого шок, вызванный ванны применения судорожного наркотиков и спонтанных припадков, записанные в генетически модифицированной рыбы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Внеклеточной метод записи, представленные здесь позволяет очень чувствительный и быстрый анализ активности мозга. Эти записи аналогичны электроэнцефалографии (ЭЭГ) мониторинг обычно используется для оценки наличия аномальных электрических разрядов (например, арест) в моделях г…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор хотел бы поблагодарить Питера Кастро и Мэтью Dinday к их скорейшему усилия по созданию данио рерио в лаборатории. Эта работа финансировалась Национальным институтом здоровья EUREKA гранта (# R01NS079214-01).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 kHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer’s instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
Referências
- Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49 (2011).
- Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93 (2), 231 (2011).
- Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439 (2002).
- Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690 (2012).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216 (2000).
- Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1 (1996).
- Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neurociência. 131 (3), 759 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48 (6), 1151 (2007).
- Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39 (2006).
- Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51 (4), 592 (2010).
- Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138 (20), 4555 (2011).
