Un modelo de ratón ortotópico de carcinoma de tiroides anaplásico

1. Preparación de células Notas: 1) RPMI 1640 completo basado en la cultura receta medios (500 ml) contiene 435 ml RPMI 1640, 50 ml de FBS inactivado por calor, los aminoácidos no esenciales 5 ml, piruvato de sodio 5 ml, 5 ml de antibiótico antimicótico; 2) lugar matrigel a 4 º C un día antes de la recogida de células. Línea celular humana ATC THJ-11T 8 se cultivan en placas de cultivo de 6 pocillos y se cosechan una vez que el 80-90% de confluencia. Precipitar las células por centrifugación a 200 g durante 4 minutos a temperatura ambiente. Aspirar los medios de comunicación y las células se resuspenden en medio RPMI 1640 [2 ml / placa de 6]. Tome un pequeño volumen de la suspensión de células, añadir a un volumen de 0,4% de colorante azul tripán y determinar la densidad celular usando TC10 contador de células automatizado. Calcular el volumen de suspensión celular necesario para obtener 5 x 10 5 células / ratón veces los ratones número inyectables. Nota: Para garantizar la publicidad equiparar suspensión celular para inyección, preparar células como si se inyecta el doble del número de los ratones (por ejemplo, si la inyección de 5 ratones, a continuación, preparar la suspensión celular como si estuviera inyectando 10 ratones). Transferencia volumen necesario de la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml. Precipitar las células por centrifugación a 200 g durante 4 minutos a temperatura ambiente. Aspirar los medios de comunicación y las células se resuspenden en RPMI completo 1640. Transfiera las células a un tubo de 1,6 ml, añadir 1 volumen de matrigel y mezclar suavemente con la pipeta lentamente dentro y fuera. Nota: Cada ratón recibirá 10 l de la suspensión / matrigel cóctel celular. Dado que las células 5 x 10 5 en suspensión en un volumen de 10 l inyectable se han utilizado con éxito en anteriores estudios de ATC ortotópico 9-10, utilizamos los parámetros en este informe. Coloque suspensión de células en hielo hasta que esté listo para su uso. _title Preparación "> 2 Mouse. Limpiar la zona quirúrgica, que incluye el microscopio de disección y el área circundante, limpiando todas las superficies con etanol al 70%. Encienda las lámparas / almohadillas térmicas, donde los animales se recuperan de la cirugía. Administrar 0,1 ml de ketamina / xilazina (cóctel de fármacos que consta de ketamina 9 mg / ml y xilazina 1mg/ml) por 10 g de peso corporal por vía intraperitoneal utilizando un 1 ml, 27G ½ "jeringa de tuberculina. Preparación para la cirugía del ratón: 1) afeitarse región del cuello de ratón (de la línea de la mandíbula hacia arriba del esternón y fuera de los brazos), 2) frote el área quirúrgica tres veces con chorhexadine cuadrados de gasa empapados, 3) scrub último hecho con betadine gasa empapada, 4 ) aplicar suavemente pomada para los ojos para evitar que los ojos se sequen. Compruebe reflejo pedal para garantizar ratón está sedado adecuadamente. Coloque animal en decúbito dorsal sobre una barrera de campo estéril desechable bajo el microscopio de disección y asegurar al animal en su lugar con cinta de tela. Manos y pi Scrubsingernails a continuación, poner los guantes quirúrgicos estériles. De una manera estéril, la cirugía abierta empacar y organizar instrumentos. Coloque paño estéril sobre animales, dejando solo sitio quirúrgico expuesto. 3. Surgical Acceso a la tiroides y la inyección de células El uso de un estéril, desechable bisturí, hacer una incisión longitudinal de 1 a 1,5 cm a lo largo de la línea media de la garganta. Nota: La desviación de la línea media complica más profundo de corte para acceder a la tráquea. Bastante incisión precisa le permite tomar el pelo y cortar a través del tejido membranoso que sostiene glándulas salivales izquierdo y derecho y reduce la probabilidad de mellar o cortar grandes arterias. Hacer una segunda incisión en los músculos que rodean la correa de la tráquea a continuación, tire de la parte derecha de la incisión del músculo a un lado para exponer la glándula tiroides derecha. Hemostats se pueden utilizar en este momento para mantener la capa muscular de unparte para facilitar el acceso a la glándula tiroides (Figura 1). Nota: Como alternativa, si el procedimiento realizado por dos miembros del personal quirúrgico, la capa muscular puede simplemente ser retenido con una pinza mientras una jeringa inyectable lista se entrega al cirujano por el personal de asistencia. Inyecte lentamente 10 l de suspensión celular en la glándula tiroides a la derecha con una "jeringa de insulina 31G 5/16 a continuación, retire con cuidado la aguja. 4. Clausura del sitio quirúrgico y la recuperación del ratón Capa muscular de sutura con 6,0 material de sutura utilizando ya sea un estilo sutura continua o interrumpida. Puntada de la piel de la misma manera. Aplicar una capa de ungüento antibiótico triple directamente sobre sitio de la incisión. Permitir animal pueda recuperarse en decúbito dorsal sobre almohadilla térmica. Una vez animal puede lograr decúbito esternal sin ayuda, que puede ser colocado de nuevo con otros ratones. <p class = "jove_title"> 5. Monitoreo Post-operatorio y la recogida de tejidos Revise el sitio de la incisión y la salud general de los animales todos los días durante una semana después de la cirugía, a continuación, comprobar una vez por semana. Si las suturas están todavía intactas después de 14 días, se retiran. Nota: Los animales que presentan signos de deterioro de la salud (por ejemplo, pérdida de peso sustancial, el cabello desaliñado, dificultad para respirar) deben ser sacrificados y los tejidos tomados. Una vez que los ratones han llegado a un punto de tiempo después de la operación predeterminada, administrar ketamina / xilazina como se ha descrito anteriormente para sedar. Perfundir animales intracardiaca y la cosecha de tiroides / tráquea y otros tejidos de interés (no descrita en detalle aquí).