Ортотопическая мышиной модели рака щитовидной железы Анапластический

1. Подготовка клеток Примечания: 1) в комплекте RPMI 1640 питательных сред на основе рецептов (500 мл) содержит 435 мл RPMI 1640, 50 мл инактивированной нагреванием FBS, 5 мл несущественные аминокислоты, 5 мл пирувата натрия, 5 мл противогрибковым антибиотикам, 2) место матригель при 4 ° С за один день до сбора клеток. УВД человека клеточной линии THJ-11T 8 выращивают в 6-луночные планшеты культуры и собирали один раз 80-90% сливной. Гранул клетки центрифугированием при 200 х г в течение 4 мин при комнатной температуре. Аспирируйте СМИ и ресуспендирования клеток в среде RPMI 1640, [2 мл / 6 лунками]. Возьмите небольшой объем клеточной суспензии, добавить его к одному объему 0,4% трипанового синего красителя и определить плотность клеток TC10 использованием автоматического счетчика Cell. Рассчитать объем клеточной суспензии, необходимые для получения 5 х 10 5 клеток / мышь раза число мышей инъекцией. Примечание: Для обеспечения объявление приравнять клеточной суспензии для инъекций, подготовить клетки, как будто вы инъекционных двойных количество мышей (например, если инъекционных 5 мышей, а затем подготовить клеточной суспензии, как будто вы были потребителями инъекционных 10 мышей). Передача необходимый объем клеточной суспензии в 15 мл коническую трубку. Гранул клетки центрифугированием при 200 х г в течение 4 мин при комнатной температуре. Аспирируйте СМИ и ресуспендируйте клеток в полной RPMI 1640. Передача клетки 1,6 мл пробирку, добавляют 1 объем матригель и аккуратно, медленно пипетки и выход. Примечание: Каждая мышь получит 10 мкл клеточной суспензии / Матригель коктейль. С 5 х 10 5 клеток приостановлены в 10 мкл объема инъекций успешно использовались в предыдущих исследованиях УВД ортотопический 9-10, мы использовали те параметры, в настоящем докладе. Место для клеточной суспензии на льду до использования. _title "> 2. Подготовка Мышь Очистите хирургической зоны, включающей рассекает сферу и его окрестностях, путем протирания всех поверхностей с 70% этанола. Включите нагревательные лампы / колодки, где животные будут восстанавливается после операции. Администрирование 0,1 мл кетамина / ксилазина (препарат коктейль, состоящий кетамина 9 мг / мл и ксилазина 1mg/ml) в расчете на 10 г массы тела внутрибрюшинно с использованием 1 мл, 27G ½ "туберкулин шприца. Подготовка к операции мыши: 1) брить шею область мышиного (от линии челюсти верхней части грудины и к оружию), 2) скраб хирургической области три раза chorhexadine пропитанной марли квадратов, 3) окончательное скраб сделано бетадином пропитанной марли, 4 ) осторожно применять глазную мазь, чтобы предотвратить сухость глаз. Проверьте педаль рефлекс для обеспечения адекватного мышь седации. Поместите животное в спинных лежачее положение одноразовый стерильный барьер поля под рассекает сферу и защитить животных в месте с тканевой лентой. Scrubs рук и ногingernails затем надеть стерильные хирургические перчатки. В стерильных моды, открытой хирургии упаковать и расставляем орудия. Наведите стерильная салфетка над животными, оставив только хирургическое сайте подвергаются. 3. Хирургический доступ к щитовидной железы и инъекции клеток Используя стерильный, одноразовый скальпель, сделать 1-к-1,5 см продольный разрез вдоль средней линии горла. Примечание: Отклонение от средней линии глубокой резки усложняет доступ к трахее. Довольно точное срединный разрез позволяет дразнить и прорезать мембранной ткани удерживая левую и правую слюнных желез вместе и уменьшает шанс никующих или отделение крупных артерий. Сделать второй разрез в ремень мышцы, окружающие трахею затем вытащить правой стороны надрезанные мышц в сторону, чтобы подвергать правой щитовидной железы. Hemostats можно использовать в этот момент провести мышечного слоячасти для легкого доступа к щитовидной железе (рис. 1). Примечание: Кроме того, если процедура выполняется двумя хирургического персонала, мышечный слой может быть просто сдерживали щипцами в то время как готовые инъекционные шприцы и вручается хирург вспомогательного персонала. Медленно введите 10 мкл клеточной суспензии в правую щитовидной железы использованием 31G 5/16 "инсулиновый шприц Затем аккуратно удалить иглу. 4. Закрытие операционного и мышь восстановления Шовный мышечный слой с 6,0 сшивания материала с использованием непрерывной или прерванный наложения швов стиля. Стежка кожи таким же образом. Нанесите слой тройной антибиотик мазь непосредственно на месте разреза. Разрешить животного восстанавливаться в спинных лежачее положение теплую грелку. Как только животное может достичь грудины лежачее положение без посторонней помощи, он может быть помещен обратно с другими мышами. <р = класса "jove_title"> 5. Послеоперационный мониторинга и сбора ткани Проверить сайт разрез и общее состояние здоровья животного ежедневно в течение недели после операции, а затем проверить раз в неделю. Если швы остаются нетронутыми после 14 дней, они удаляются. Примечание: Животные, демонстрирующие признаки ухудшения здоровья (например, значительная потеря веса, потрепанными волосами, затрудненное дыхание) следует усыплять и тканей собраны. Как только мыши достигли заданной послеоперационный момент времени, управлять кетамин / ксилазина, как описано выше успокоить. Заливать животных внутрисердечно и урожай щитовидной железы / трахеи и других тканей интереса (подробно не описаны здесь).