甲状腺未分化癌の同所性マウスモデル

1。細胞調製 注 2）場所マトリゲル1）完全RPMI 1640ベースの文化·メディア·レシピ（500ミリリットル）435ミリリットルRPMI 1640、50ミリリットル熱不活性化FBS、5ミリリットル非必須アミノ酸、5ミリリットルのピルビン酸ナトリウム、5ミリリットル抗生物質抗真菌が含まれています4℃で一日のセルの収穫前に。 人間ATC細胞ラインTHJは-11T 8は 6ウェル培養プレートで増殖させた80〜90％コンフルエントに一度収穫される。 室温で4分間200×gで遠心分離によって細胞をペレット化する。 RPMI 1640培地[2ミリリットル/ 6ウェルプレート]でメディアと再懸濁した細胞を吸引。 0.4％トリパンブルー色素の一つのボリュームに追加し、TC10自動セルカウンターを用いて細胞密度を決定し、細胞懸濁液の小体積を取る。 注入5×10 5細胞/マウス倍の数のマウスを得るために必要な細胞懸濁液の体積を計算する。 注：広告を確保するためあなたは、マウスの二重数を（ 例えば 5匹のマウスを注入する場合は、10匹のマウスを注入したかのように、その後、細胞懸濁液を準備）を注入されているかのように、注射用の細胞懸濁液を同一視する、細胞を調製。 15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液の必要な量を転送します。 室温で4分間200×gで遠心分離によって細胞をペレット化する。 完全RPMI 1640培地でのメディア再懸濁した細胞を吸引。 1.6 mlチューブに細胞を移しマトリゲルの1ボリュームを追加して、徐々に内と外ペッティングにより穏やかに混合。 注：各マウスは細胞懸濁液/マトリゲルカクテル10μlのを受け取ります。 10μlの注射量に懸濁し、5×10 5個の細胞が正常に以前のATC同所の研究9-10で使用されてきたので、本報告書でこれらのパラメータを使用していました。 使用する準備まで氷上で細胞懸濁液を置きます。 _title "> 2。マウスの準備 70％エタノールですべての表面を拭いて、解剖範囲と周辺地域を含む外科的なゾーンを、清掃してください。 動物は手術から回復される加熱ランプ/パッドをオンにします。 1ミリリットル、27G½ "ツベルクリン注射器を用いて10グラム体重腹腔あたり0.1ミリリットルケタミン/キシラジン（ケタミン9 mg / mlのとキシラジン1mg/mlのから成る薬物カクテル）を管理。 手術のための準備マウス：1）マウス（あごのラインから胸骨と外のトップに腕に）、2の頸部を剃る）手術領域をスクラブ三回chorhexadine浸したガーゼの正方形と、3）ベタジン浸したガーゼで行う最後のスクラブ、4 ）優しく乾燥から目を防ぐために、眼軟膏を適用します。 マウスが十分に鎮静されていることを確認するために反射ペダルチェック。 解剖スコープの下に使い捨て無菌フィールドバリアに背側横臥に動物を置き、布テープで所定の位置に動物を固定します。 スクラブ手とfingernailsその後無菌手術用手袋を置く。 滅菌方法では、開腹手術はパックや楽器を手配。 暴露だけ手術部位を残して、動物を介して無菌ドレープを置きます。 3。甲状腺および細胞注入に外科用アクセス滅菌、使い捨てメスを使用して、喉の正中線に沿って1対1.5センチメートル縦切開を行います。 注：正中線からの偏差は、気管にアクセスすることがより深いカッティングが複雑になります。かなり正確な正中切開は、あなたが一緒に左右の唾液腺を保持膜組織を介していじめるとカットすることができ、大規模な動脈ニッキングまたは切断の可能性を低減します。 気管周囲のストラップの筋肉に第二切開を行い、次に右甲状腺を公開する側に切開筋肉の右側を引っ張る。 止血は、筋層を保持するために、この時点で使用することができる甲状腺（ 図1）に簡単にアクセスするためのパーツ。 注：手順は、2つの手術スタッフによって実行された場合準備注射シリンジは支援スタッフが外科医に渡されている間あるいは、筋層が単に鉗子で戻って開催することができる。 ゆっくりゆっくり針を除去31G 5/16 "インスリン注射器を使用して右の甲状腺に細胞懸濁液10μlを注入。 4。手術部位とマウスの回復の閉鎖どちら連続または断続縫合スタイルを使用して6.0縫合材料と縫合筋層。 同じ方法でステッチが皮膚。 直接切開部位上トリプル抗生物質軟膏の層を適用します。 動物は暖かい加熱パッドで背側横臥位で回復することができます。動物が支援なし胸骨横臥位を実現することができたら、それを他のマウスに戻って配置することができる。 <Pクラス= "jove_title"> 5。術後モニタリングとティッシュコレクション手術後一週間、毎日動物の切開部位と全体的な健康状態を確認し、週に一度確認してください。縫合糸は、14日後に無傷のままである場合、それらは除去される。 注：健康の衰え（ 例えばかなりの減量、だらしない髪は、呼吸をこじつけ）の兆候を示す動物を安楽死させ、組織が ​​収集されるべきである。 一度マウスはキシラジン/ケタミン落ち着いた、上記説明するように管理し、所定の手術後の時点に達しています。 心臓内に動物を灌流し、収穫甲状腺/気管や関心のある他の組織（ここでは詳細に説明しない）。