Summary

Fare Beyin dilimleri içinde Nikotinik Asetilkolin Reseptör Fonksiyon Okumak Uyuşturucu Yerel Uygulama

Published: October 29, 2012
doi:

Summary

Bu yazıda, akut izole beyin dilimleri arasında nöronlarda ligand kapılı iyon kanal fonksiyonunu incelemek için kullanışlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, standart yama kelepçe teknikler kullanılarak kaydedilmiş nöronlar için ilaçların lokal uygulama için bir ilacın dolu bir mikropipet kullanımını içerir.

Abstract

Tütün kullanımı kanser, kalp hastalığı, amfizem, ve inme gibi birçok sağlık sorunlarına yol açar. Sigara bağımlılığı merkezi sinir sistemi boyunca nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChRs) nikotinin biyofiziksel ve hücresel faaliyetler kaynaklanıyor yaygın bir nöropsikiyatrik bozukluktur. Nikotin bağımlılığı ile ilgili beyin bölgelerinde mevcut çeşitli nAChR alt anlamak önemli bir önceliktir.

Bu tür bütün-hücre yama klempi veya iki elektrotlu voltaj kelepçesi elektrofizyolojik kayıtları gibi teknikleri kullanan deneyler ilgi nAChRs farmakolojik karakterizasyonu için yararlıdır. Bu tür memeli doku kültürü hücreleri veya Xenopus laevis oosit olarak Hücreler ifade nAChRs, fiziksel olarak izole edilir ve bu nedenle kolayca modern farmakoloji araçları kullanılarak incelenmiştir. Hedef reseptör zaten bilinen, özellikle çok gelişme, bu teknikler kullanılarak yapılmış birnd ektopik ifade kolayca elde edildi. Akut laboratuar fareleri ya da sıçanlar hasat beyin kesitleri içinde nöronlarda: Ancak, çoğu zaman kendi doğal ortamında nAChRs incelemek için gereklidir. Örneğin, bu tür fareler α4 L9'A fareler 1 ve α6 L9, 2'S fareler gibi "duyarlı" nAChR alt üniteleri ifade eden, spesifik nAChR alt birim olan fonksiyonel ekspresyonu esas nöronların kesin tanımlanması için izin verir. Beyin dilimleri içerisinde nöronlardan gelen tüm-hücre yama klemp kayıtları rutin yetenekli elektrofizyolog tarafından yapılmasına rağmen, yerel olarak böyle asetilkolin veya bir beyin dilim içinde kaydedilen hücreye nikotin gibi ilaçların uygulamak zordur. Superfusate içine ilaçların seyreltilmesi (banyo uygulaması) hızla geri dönüşü yoktur, ve U-tüp sistemleri kolayca beyin dilimleri ile çalışmak için adapte değildir.

Bu yazıda, hızla yetişkin m Kaydedilen nöronlar nAChR-aktive edici ilaçları uygulamak için kullanılan bir yöntem tarifbeyin dilimleri Ouse. Standart tam hücre kayıtları dilimleri nöronların yapılır ve ilgi bir ilaç ile dolu ikinci bir mikropipet kaydedilen hücrenin yakınında pozisyon içine manevra edilir. Ilaç ile dolu pipet içine basınçlı hava, nitrojen veya inert bir enjeksiyon kaydedilmiş hücrenin üzerine pipetle çıkartılabilmesi için ilaç solüsyon bir miktar neden olur. Bu yöntemi kullanarak, nAChR-aracılı akımları milisaniyelik doğrulukla çözülecek edebiliyoruz. İlaç uygulama zamanları kolayca değiştirilebilir ve uyuşturucu dolu bir pipet konsantrasyon-cevap eğrileri tek bir nöron için oluşturulmuş olması için izin veren yeni bir pipet yardımıyla çekilerek değiştirilebilir. NAChR nörobiyolojide bağlamında tarif olmasına rağmen, bu yöntem beyin kesitleri nöronları içinde ligand-kapılı iyon kanalları ya da reseptörleri birçok türleri çalışmak için yararlı olacaktır.

Protocol

1. Beyin Dilim Hazırlama ve Elektrofizyoloji için çözümler hazırlanması Beyin kesitleri hazırlanması için çözümler daha önce 3, 4 tarif edilmiştir. 93. N-metil D-glukamin, 2,5 KCl, 1.2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25: N-metil D-glukamin (NMDG)-tabanlı olarak aşağıdaki bileşime sahip bir kesme ve geri kazanım solüsyonu (mM cinsinden) hazırlanması glikoz, 5 Na + askorbat, 2 tioüre, 3 Na + piruvat, 10 MgSO4…

Representative Results

Deneylerde, rutin dopamin (DA) üreten ventral tegmental alan (VTA) ve substantia nigra pars compactadaki (SNC) nöronlardan kaydedebilirsiniz. Voltaj-clamp modunda, asetilkolin veya bu hücrelere nikotin basınç uygulama tipik olarak 100-200 ms (Şekil 1A-B) dahilinde zirveye ulaştığı bir hızlı, içe doğru katyon akım neden olur. Mevcut bozulması büyük ölçüde etki bölgesinden ilacın difüzyon tarafından dikte edilir ve dilim enzimler mevcut olup olmadığı, bir inaktif biçim içine …

Discussion

Bu çalışmada sunulan yöntem, beyin dilim hazırlıkları ligand kapılı iyon kanal fonksiyonunu incelemek için geniş yararlıdır. Bununla birlikte, önemli ölçüde deneysel veriler, bu yöntemi kullanarak gelen nihai ürünün kalitesi ve yeniden üretilebilirlik etkileyecek bir dizi faktör vardır. Örneğin, uyarılmış akımları ilaç ile dolu bir pipet ucu çapına karşı çok duyarlıdır. Küçük ipuçları ilaç solüsyonu ve düşük direnç ile büyük ipuçları kaydedilen hücre ve kayıt elekt…

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe DA030396 tarafından desteklenmiştir. Yararlı tartışma ve yazının eleştirisi için Drenan laboratuar üyeleri sayesinde. Mi Özel sayesinde erişkin fare beyin dilimleri ile ilgili tavsiyeler için teknik yardım ve Jonathan Thomas Ting için Kim Ran.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
N-Methyl D-glucamine Sigma M2004
KCl Sigma P3911
NaH2PO4 Sigma S9638
NaHCO3 Sigma S6014
HEPES Sigma H3375
glucose Sigma G5767
Na+ ascorbate Sigma A4034
thiourea Sigma T8656
Na+ pyruvate Sigma P2256
MgSO4•7H2O Sigma 230391
CaCl2•2H20 Sigma 223506
NaCl Sigma S9625
Na+ pentobarbital Vortech Pharmaceuticals 76351315
potassium gluconate Sigma G4500
EGTA Sigma E3889
Mg-ATP Sigma A9187
GTP Sigma G8877
DSK-Zero 1 Vibrating slicer Ted Pella, Inc.
P-97 Flaming/Brown micropipette puller Sutter
RC-27 Recording chamber Warner
TC-344B Perfusion heater controller Warner 640101
SH-27B Solution heater Warner 640102
Nikon FN-1 Nikon
C-7500 CCD Video camera Hamamatsu
Picospritzer III General Valve Co.
MP-285 Micromanipulator Sutter
PA-100 Piezoelectric translator piezosystem jena, Inc.
12V40 piezo amplifier piezosystem jena, Inc.
Axopatch 200B Molecular Devices Corp.
Digidata 1440A Molecular Devices Corp.

Referências

  1. Tapper, A. R. Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science. 306, 1029-1032 (2004).
  2. Drenan, R. M. In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors. Neuron. 60, 123-136 (2008).
  3. Zhao, S. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).
  4. Peca, J. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472, 437-442 (2011).
  5. Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum. J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).
  6. Pidoplichko, V. I. Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons. Nature. 390, 401-404 (1997).
  7. Nashmi, R. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
  8. Xiao, C. Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).
  9. Cohen, B. N. Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior. Neurociência. 200, 31-41 (2012).
  10. Drenan, R. M. Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors. J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).
  11. Grady, S. R. Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors. Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).
  12. Drenan, R. M. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits. Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).
  13. Keath, J. R. Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons. J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).
  14. Mansvelder, H. D. Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area. Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).
  15. Lee, S. The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors. J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).
  16. Margolis, E. B. Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons. PLoS One. 5, e15222 (2010).
  17. Margolis, E. B. The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons. J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).
  18. Couey, J. J. Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex. Neuron. 54, 73-87 (2007).
  19. Yang, K. Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons. J. Physiol. 587, 345-361 (2009).
  20. Endo, T. Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus. J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).
  21. Bouzat, C. New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors. J. Physiol. Paris. , (2011).
check_url/pt/50034?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (68), e50034, doi:10.3791/50034 (2012).

View Video