Summary

Ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio

Published: April 30, 2013
doi:

Summary

Aquí desarrollamos las herramientas necesarias para<em> Ex vivo</em> Imágenes en vivo de rastrear las divisiones de células individuales en el ratón E8.5 neuroepitelio

Abstract

Hemos desarrollado un sistema que integra imágenes en vivo de los marcadores fluorescentes y las rebanadas de cultivo embrionario neuroepitelio del ratón. Nos aprovechamos de las actuales líneas de ratones de células linaje genético rastreo: una línea Cre tamoxifeno-inducible y una línea reportero Cre expresan dsRed por recombinación Cre-mediada. Mediante el uso de un nivel relativamente bajo de tamoxifeno, hemos sido capaces de inducir la recombinación en un pequeño número de células, lo que permite que sigamos divisiones celulares individuales. Además, se observó la respuesta transcripcional de la proteína Sonic Hedgehog (Shh) de señalización utilizando un Olig2-EGFP transgénicos línea 1-3 y que supervisó la formación de los cilios mediante la infección de la porción cultivada con virus que expresa el marcador de los cilios, SSTR3-GFP 4. Con el fin de imagen del neuroepitelio, que cosecharon embriones a E8.5, aislado del tubo neural, montado la rebanada neuronal en condiciones de cultivo adecuadas en la cámara de formación de imágenes y realiza de lapso de tiempo de imagen confocal. Nuestro exvivo método de imagen en directo nos permite trazar divisiones celulares individuales para evaluar el tiempo relativo de formación de los cilios primarios y la respuesta de Shh en forma fisiológicamente relevante. Este método se puede adaptar fácilmente el uso de marcadores fluorescentes distintos y proporciona el campo de las herramientas con las que monitorean el comportamiento de células in situ y en tiempo real.

Protocol

Los ratones adultos son sacrificados por dislocación cervical mecánico. Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el IACUC y el Comité de Seguridad de la Biotecnología en la Universidad de Emory. 1. Generación de Embriones Cruz Cre line tamoxifeno inducible, CAGGCreER y reportero línea dsRedCre (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Figura 1) 5,6. Para controlar el tiempo relativo de respuesta Shh a las células hijas, y la línea transv…

Representative Results

Aquí hemos realizado ex vivo de imágenes en directo de las divisiones de células individuales dentro de la E8.5 neuroepitelio ratón. Para marcar las células individuales, se indujo la recombinasa Cre en un subconjunto de células que contienen una línea reportero Cre que expresaban DsRED tras la recombinación 5,6 (Figura 3A). Por lo tanto, 48 horas más tarde pudimos observar divisiones celulares individuales en ex vivo de imágenes (figuras 4A-D). Al…

Discussion

Nuestro sistema ex vivo nos permite observar directamente las divisiones de células individuales dentro del neuroepitelio en desarrollo en tiempo real. A modo de ejemplo se analizaron las divisiones celulares en el tubo neural embrionario del ratón y monitoreamos ni formación cilio o respuesta Shh. Confirmamos nuestras imágenes de los resultados (n = 24) fueron consistentes con los resultados de las secciones fijas (n = 178) que indican nuestra técnica proporciona datos fisiológicamente …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este proyecto de investigación fue apoyada por un suplemento de ARRA, 5 R01 NS056380. Se prestó apoyo adicional a través de la Core Vector viral y el Core Microscopía de la Emory Neurociencia NINDS Core Instalaciones subvención, P30NS055077. Damos las gracias al ratón transgénico Emory y Gene Targeting Core para derivar la línea de ratones de GENSAT; Greg Pazour para la línea celular SSTR3-GFP IMCD3 estable, y Bradley Yoder para la SSTR3-GFP lentiviral construir. Los anticuerpos monoclonales se obtuvieron de los Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma, desarrollado bajo los auspicios de la NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa, Departamento de Ciencias Biológicas, Iowa City, IA 52242. Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el IACUC y el Comité de Seguridad de la Biotecnología en la Universidad de Emory.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J Jackson Laboratory 005438  
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd MMRRC, 010555-UCD  
CAGGCreER Jackson Laboratory 003724  
Tamoxifen Sigma T5648  
DMEM/F12 (1:1) GIBCO 21041-025  
Newborn calf serum Lonza 14-416F  
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122  
Rat Serum SD male Harlan Bioproducts 4520  
1M Hepes BioWhittaker 17-737E  
L-Glutamine GIBCO 21041-025  
Light mineral oil Sigma M8410  
Sstr3-GFP lentivirus Emory Viral Core    
Micro-knife, size 0.025 mm Electron Microscopy Sciences 62091  
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish MatTek P35GC-0-10-C  
100% petroleum jelly Kroger FL9958c  
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope Nikon    
NIS Elements software Nikon    
Imaris 3D software Bitplane AG Imaris 7.2.3  
OCT Tissue-Tek 4583  
Cryostat Leica CM1850  
Heat-inactivated sheep serum Invitrogen 16210-072  
Triton X-100 Fisher Scientific BP151  
Parafolmaldehyde Sigma P6148  
Phosphate Buffer Lab made    
Rat monoclonal anti-RFP (5F8) Chromotek 110411  
Rabbit anti-Arl13b serum NeuroMab    
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 NeuroMab    
Rabbit anti-Olig2 Chemicon AB9610  
Mouse monoclonals Pax6 Developmental Hybridoma Bank Pax6  
Mouse monoclonalsShh Developmental Hybridoma Bank 5E1  
Mouse monoclonals Nkx2.2 Developmental Hybridoma Bank 74.5A5  
Rabbit polyclonal Ki67 Abcam AB15580  
Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11029  
Alexa Fluor 568 Molecular Probes A11031  
Alexa Fluor 350 Molecular Probes A11046  
Hoechst Fisher AC22989  
TO-PRO-3 Invitrogen T3605  
ProLong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36934  

Referências

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Citar este artigo
Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (74), e4439, doi:10.3791/4439 (2013).

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