Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium
Summary
Aqui vamos desenvolver as ferramentas necessárias para<em> Ex vivo</em> Imagens ao vivo para traçar divisões celulares individuais no rato E8.5 neuroepithelium
Abstract
Nós desenvolvemos um sistema que integra imagens ao vivo de marcadores fluorescentes e as fatias de cultura de neuroepithelium embrionário mouse. Aproveitamos mouse linhas existentes para a célula de linhagem genética traçado: a linha Cre tamoxifeno induzível e uma linha repórter Cre expressar dsRed sobre recombinação Cre-mediada. Ao utilizar um nível relativamente baixo de tamoxifeno, fomos capazes de induzir a recombinação em um pequeno número de células, que permite que se siga as divisões celulares individuais. Além disso, observou-se a resposta de transcrição para o Sonic Hedgehog (Shh) de sinalização usando um OLIG2-eGFP transgênico linha 1-3 e acompanhámos formação de cílios por infectar a fatia culta com vírus expressando o marcador de cílios, Sstr3-GFP 4. A fim de imagem neuroepithelium, colhemos embriões em E8.5, isolada do tubo neural, montado a fatia neural em condições de cultura adequadas para a câmara de imagens e realizada lapso de tempo de imagem confocal. Nosso exmétodo in vivo de imagens ao vivo nos permite traçar divisões celulares individuais para avaliar a temporização relativa de formação de cílios e resposta Shh de um modo fisiologicamente relevante. Este método pode ser facilmente adaptado por meio de marcadores fluorescentes distintas e fornece o campo com o qual as ferramentas para controlar o comportamento de células in situ e em tempo real.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nosso sistema ex vivo nos permite observar diretamente divisões celulares individuais dentro do neuroepithelium em tempo real em desenvolvimento. Como exemplo, examinamos divisões celulares dentro do rato tubo neural embrionário e monitorados ou formação cílio ou resposta Shh. Confirmámos nossos resultados de imagem (n = 24) foram consistentes com os resultados de secções fixas (n = 178), indicando a nossa técnica fornece dados fisiologicamente relevantes.
<p class="jove_content"…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projecto de investigação foi apoiada por um suplemento ARRA, 5 R01 NS056380. Apoio adicional foi fornecido pela Viral Vector Core e do Núcleo de Microscopia da Emory Neuroscience NINDS Núcleo Instalações concessão, P30NS055077. Agradecemos o mouse Emory Transgênicos e Gene Segmentação do núcleo para a derivação da linha de mouse da GENSAT; Greg Pazour para o SSTR3-GFP IMCD3 linha celular estável, e Bradley Yoder para o Sstr3-GFP lentiviral construir. Os anticorpos monoclonais foram obtidos a partir dos estudos do desenvolvimento Hibridoma Bank, desenvolvido sob os auspícios da NICHD, e mantido pela Universidade de Iowa, Departamento de Ciências Biológicas, Iowa City, IA 52242. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo IACUC e da Comissão de Biossegurança da Universidade de Emory.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% petroleum jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Hoechst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
Referências
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