Summary

Ex vivo Levende Imaging av single celledelinger i mus neuroepithelium

Published: April 30, 2013
doi:

Summary

Her kan vi utvikle de nødvendige verktøy for<em> Ex vivo</em> Sanntidsavbildning å spore enkelt celledelinger i musen E8.5 neuroepithelium

Abstract

Vi har utviklet et system som integrerer direkte avbildning av fluorescerende markører og dyrking skiver av embryonale mus neuroepithelium. Vi tok nytte av eksisterende mus linjer for genetisk celle avstamning tracing: en tamoxifen-induserbar Cre linje og en Cre reporter linjen uttrykker DsRed på Cre-mediert rekombinasjon. Ved å bruke et relativt lavt nivå av tamoxifen, var vi i stand til å indusere rekombinasjon i et lite antall celler, tillater oss å følge de enkelte celledelinger. I tillegg observerte vi transcriptional svar på Sonic Hedgehog (Hysj) signal ved hjelp av en Olig2-eGFP transgene linjen 1-3 og vi overvåkes dannelsen av flimmerhårene ved å infisere den kultiverte skive med virus som uttrykker flimmerhårene markør, Sstr3-GFP fire. For å avbilde neuroepithelium, vi høstet embryoer på E8.5, isolert nevralrøret, montert det nevrale skive i riktig dyrking forhold til bildebehandling kammeret og utførte time-lapse confocal bildebehandling. Vår exvivo direkte avbildning metoden gjør oss i stand til å spore enkelt celledelinger for å vurdere den relative timing av primære cilier dannelse og Hysj respons i en fysiologisk relevant måte. Denne metoden kan enkelt tilpasses ved hjelp av ulike fluorescerende markører og gir feltet de verktøyene som brukes til å overvåke celle atferd in situ og i sanntid.

Protocol

Voksne mus avlives av mekanisk halshugging. Alle dyr prosedyrene ble godkjent av IACUC og biosikkerhet Committee ved Emory University. En. Embryo Generation Cross tamoxifen-induserbar Cre linje, CAGGCreER, og dsRedCre reporter linje (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (figur 1) 5,6. Å overvåke den relative timing av Hysj respons i datter celler, kryss CAGGCreER og DsRed tråd med Olig2-eGFP BAC transgene mus (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (figur 1)…

Representative Results

Her har vi utført ex vivo direkte avbildning av encellete divisjoner innenfor E8.5 mus neuroepithelium. Å merke individuelle celler, indusert vi Cre recombinase i en undergruppe av celler som inneholder en Cre reporter linje som uttrykt DsRed ved rekombinasjon 5,6 (figur 3A). Således 48 timer senere var vi i stand til å observere enkelt celledelinger i løpet av ex vivo avbildning (figurene 4A-D). Samtidig, overvåket vi når de merkede cellene ble Hysj-…

Discussion

Vår ex vivo-systemet gjør oss i stand til å direkte observere encellete divisjoner innenfor utvikling neuroepithelium i sanntid. Som et eksempel undersøkte vi celledelinger i løpet av musen embryonale nevralrøret og overvåkes enten cilium formasjon eller Hysj respons. Vi bekreftet våre bildebehandling resultater (n = 24) var i samsvar med resultatene fra faste seksjoner (n = 178) som indikerer vår teknikk gir fysiologisk relevante data.

Vår teknikk er avh…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette forskningsprosjektet ble støttet av en Arra Supplement, 5 R01 NS056380. Ekstra støtte ble gitt gjennom Viral Vector Core og den Mikroskopi Kjernen i Emory Neuroscience ninds Kjerne utstyr stipend, P30NS055077. Vi takker Emory transgene mus og Gene Targeting Kjerne for å utlede musen linje fra GENSAT; Greg Pazour for stallen SSTR3-GFP IMCD3 cellelinje, og Bradley Yoder for Sstr3-GFP lentiviral konstruere. Monoklonale antistoffer ble innhentet fra Developmental Studies hybridom Bank, utviklet i regi av NICHD og vedlikeholdes av The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, 52242 IA. Alle dyr prosedyrene ble godkjent av IACUC og biosikkerhet Committee ved Emory University.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J Jackson Laboratory 005438  
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd MMRRC, 010555-UCD  
CAGGCreER Jackson Laboratory 003724  
Tamoxifen Sigma T5648  
DMEM/F12 (1:1) GIBCO 21041-025  
Newborn calf serum Lonza 14-416F  
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122  
Rat Serum SD male Harlan Bioproducts 4520  
1M Hepes BioWhittaker 17-737E  
L-Glutamine GIBCO 21041-025  
Light mineral oil Sigma M8410  
Sstr3-GFP lentivirus Emory Viral Core    
Micro-knife, size 0.025 mm Electron Microscopy Sciences 62091  
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish MatTek P35GC-0-10-C  
100% petroleum jelly Kroger FL9958c  
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope Nikon    
NIS Elements software Nikon    
Imaris 3D software Bitplane AG Imaris 7.2.3  
OCT Tissue-Tek 4583  
Cryostat Leica CM1850  
Heat-inactivated sheep serum Invitrogen 16210-072  
Triton X-100 Fisher Scientific BP151  
Parafolmaldehyde Sigma P6148  
Phosphate Buffer Lab made    
Rat monoclonal anti-RFP (5F8) Chromotek 110411  
Rabbit anti-Arl13b serum NeuroMab    
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 NeuroMab    
Rabbit anti-Olig2 Chemicon AB9610  
Mouse monoclonals Pax6 Developmental Hybridoma Bank Pax6  
Mouse monoclonalsShh Developmental Hybridoma Bank 5E1  
Mouse monoclonals Nkx2.2 Developmental Hybridoma Bank 74.5A5  
Rabbit polyclonal Ki67 Abcam AB15580  
Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11029  
Alexa Fluor 568 Molecular Probes A11031  
Alexa Fluor 350 Molecular Probes A11046  
Hoechst Fisher AC22989  
TO-PRO-3 Invitrogen T3605  
ProLong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36934  

Referências

  1. Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
  2. Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
  3. Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
  4. Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
  5. Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
  6. Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
  7. Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  8. Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
  9. Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
  10. Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), (2012).
  11. Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).
check_url/pt/4439?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (74), e4439, doi:10.3791/4439 (2013).

View Video