생체 마우스 Neuroepithelium에서 단일 세포 분열의 라이브 영상
Summary
여기에서 우리는 필요한 도구를 개발<em> 생체</em> 라이브 영상은 마우스 E8.5 neuroepithelium에서 단일 세포 분열을 추적
Abstract
우리는 형광 마커와 배아 마우스 neuroepithelium의 배양 조각의 라이브 영상을 통합하는 시스템을 개발했다. 우리는 추적 혈통 유전 셀에 대한 기존의 마우스 선을 이용했다 : 타목시펜 유도 크레 라인과 크레-매개 재조합에 DsRed를 표현하는 크레 기자 라인. 타목시펜의 상대적으로 낮은 수준을 사용함으로써, 우리는 우리가 각각의 세포 분열을 따르도록 허용하는 세포의 작은 수의 재조합을 유도 할 수 있었다. 또한, 우리는 Olig2-EGFP 유전자 변형 라인 1-3를 사용하여 소닉 고슴도치 (쉬) 신호에 대한 전사 반응을 관찰하고 우리는 섬모 마커, Sstr3-GFP 4를 표현 바이러스 배양 슬라이스를 감염시켜 섬모의 형성을 감시. 이미지 순서 neuroepithelium, 우리는 신경 튜브를 절연, E8.5에서 배아를 수확, 이미징 챔버에 적절한 배양 조건에서 신경 슬라이스를 장착 시간 경과 공 촛점 이미징을 수행 하였다. 우리의 예생체 라이브 영상 방식은 우리가 생리학 관련 방식으로 차 섬모 형성과 쉬 응답 상대 타이밍을 평가하기 위해 단일 세포 분열을 추적 할 수 있습니다. 이 방법은 쉽게 구별 형광 마커를 사용하여 적응하고 필드에게 현장에서 실시간으로 세포의 행동을 모니터링되는 도구를 제공 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리 전직 생체 시스템은 우리가 직접 실시간으로 개발 neuroepithelium 내에서 단일 세포 분열을 관찰 할 수 있습니다. 예를 들어 우리는 마우스 배아 신경관에서 세포 분열을 검토하고 섬모 형성이나 쉬 응답 중 하나를 감시. 우리는 우리의 기술 생리 학적으로 관련 데이터를 제공 나타내는 고정 부분 (n은 = 178)의 결과와 일치 하였다 우리의 이미징 결과 (N = 24)을 확인했다.
<p c…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구 프로젝트는 ARRA 보충, 5 R01 NS056380에 의해 지원되었다. 추가 지원은 바이러스 성 벡터 코어와 모리 신경 NINDS 핵심 시설 보조금, P30NS055077의 현미경 코어를 통해 제공되었다. 안정 SSTR3-GFP IMCD3 세포 라인에 대한 그렉 Pazour; 우리는 GENSAT에서 마우스 선을 파생시키기위한 모리 형질 전환 마우스 및 유전자 타겟팅 코어를 감사하고 Sstr3-GFP 렌티 바이러스에 대한 브래들리 Yoder는 구성. 단일 클론 항체는 NICHD의 후원하에 개발 된 발달 연구 브리 도마 은행에서 얻은 아이오와 대학교 생물 과학부, 아이오와 시티, 아이오와 52242에 의해 유지되었다. 모든 동물 절차 IACUC에 모리 대학의 바이오 안전성위원회에 의해 승인되었습니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% petroleum jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Hoechst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
Referências
- Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
- Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
- Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
- Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
- Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
- Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), (2012).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).
