Summary

ex vivoでマウス神経上皮における単一細胞分裂のライブイメージング

Published: April 30, 2013
doi:

Summary

ここでは、のために必要なツールを開発<em> ex vivoで</emマウスE8.5神経上皮内の単一細胞分裂をトレースする>ライブイメージング

Abstract

私たちは、蛍光マーカーおよび胚マウス神経上皮の培養スライスのライブイメージングを統合するシステムを開発しました。私たちは、トレース系統遺伝細胞のための既存のマウス系統を利用しました:タモキシフェン誘導性CreのラインとのCreレポーターラインはCreを媒介組換えによりDsRedの発現。タモキシフェンの比較的低レベルを用いて、我々は我々は、個々の細胞分裂に従うことを可能にして、少数の細胞で組換えを誘導することができた。さらに、我々は、Olig2-EGFPトランスジェニックライン1-3を使用して、我々はウイルスが繊毛マーカー、SSTR3-GFP 4を発現培養スライスを感染させることにより繊毛の形成を監視シグナリング(シーッ)ソニック·ザ·ヘッジホッグに転写応答を観察した。イメージするためには神経上皮は、我々は神経管を単離し、E8.5で胚を採取し、撮影室への適切な培養条件の神経スライスをマウントし、タイムラプス共焦点イメージングを行った。当社EX生体ライブイメージング法は、一次繊毛形成と生理学的に適切な方法でShhの応答の相対的なタイミングを評価するために、単一の細胞分裂をトレースすることを可能にします。この方法は簡単明瞭な蛍光マーカーを使用して適応され、フィールドを、その場で 、リアルタイムで細胞の挙動を監視するためにどのとツールを提供しすることができます。

Protocol

成体マウスは、機械頸椎脱臼により安楽死させる。すべての動物の手順はIACUCとエモリー大学のバイオセーフティ委員会によって承認された。 1。胚の生成クロスタモキシフェン誘導性Creをライン、CAGGCreER、およびdsRedCreレポーターライン点(Tg(CAG-Bgeo、-DsRedを* MST)1Nagy)( 図1)5,6。娘細胞、クロスCAGGCreERとOlig2-EGFP BACトランスジェニックマ…

Representative Results

ここでは、E8.5マウス神経上皮内の単一細胞分裂のex vivoでのライブイメージングを行った。個々の細胞を標識するためには、組換え5,6( 図3A)に基づいDsRedを表明したCreレポーター行を含む細胞のサブセットにCreリコンビナーゼを誘導した。したがって、48時間後に我々はex vivoでイメージング( 図4A-D)の間に単一の細胞分裂を観察することがで?…

Discussion

当社のex vivoでシステムが直接、リアルタイムで開発神経上皮内の単一細胞分裂を観察することを可能にします。例として、我々はマウス胚神経管の中に細胞分裂を検討し、繊毛形成またはShhの応答のいずれかを監視した。私たちは、イメージング結果(N = 24)私たちの技術は生理学的に適切なデータを提供示す固定部(N = 178)の結果と一致していたことを確認した。

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究プロジェクトは、ARRAサプリメント、5 R01 NS056380によってサポートされていました。追加のサポートは、ウイルスベクターコアとエモリー神経NINDSコア設備助成、P30NS055077の顕微鏡コアを介して提供されました。 SSTR3-GFPレンチウイルスコンストラクトのために、ブラッドリーYoder発信;安定SSTR3-GFP IMCD3細胞ラインのグレッグPazour、我々はGENSATからマウスラインを導出するためのコアをターゲットエモリートランスジェニックマウスと遺伝子に感謝します。モノクローナル抗体は、NICHDの後援の下で開発された発達研究ハイブリドーマ銀行、、から入手し、アイオワ大学、生物科学科、アイオワシティ、アイオワ52242によって維持された。すべての動物の手順はIACUCとエモリー大学のバイオセーフティ委員会によって承認された。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J Jackson Laboratory 005438  
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd MMRRC, 010555-UCD  
CAGGCreER Jackson Laboratory 003724  
Tamoxifen Sigma T5648  
DMEM/F12 (1:1) GIBCO 21041-025  
Newborn calf serum Lonza 14-416F  
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122  
Rat Serum SD male Harlan Bioproducts 4520  
1M Hepes BioWhittaker 17-737E  
L-Glutamine GIBCO 21041-025  
Light mineral oil Sigma M8410  
Sstr3-GFP lentivirus Emory Viral Core    
Micro-knife, size 0.025 mm Electron Microscopy Sciences 62091  
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish MatTek P35GC-0-10-C  
100% petroleum jelly Kroger FL9958c  
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope Nikon    
NIS Elements software Nikon    
Imaris 3D software Bitplane AG Imaris 7.2.3  
OCT Tissue-Tek 4583  
Cryostat Leica CM1850  
Heat-inactivated sheep serum Invitrogen 16210-072  
Triton X-100 Fisher Scientific BP151  
Parafolmaldehyde Sigma P6148  
Phosphate Buffer Lab made    
Rat monoclonal anti-RFP (5F8) Chromotek 110411  
Rabbit anti-Arl13b serum NeuroMab    
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 NeuroMab    
Rabbit anti-Olig2 Chemicon AB9610  
Mouse monoclonals Pax6 Developmental Hybridoma Bank Pax6  
Mouse monoclonalsShh Developmental Hybridoma Bank 5E1  
Mouse monoclonals Nkx2.2 Developmental Hybridoma Bank 74.5A5  
Rabbit polyclonal Ki67 Abcam AB15580  
Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11029  
Alexa Fluor 568 Molecular Probes A11031  
Alexa Fluor 350 Molecular Probes A11046  
Hoechst Fisher AC22989  
TO-PRO-3 Invitrogen T3605  
ProLong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36934  

Referências

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Citar este artigo
Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (74), e4439, doi:10.3791/4439 (2013).

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