Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio
Summary
Qui sviluppiamo gli strumenti necessari per<em> Ex vivo</em> L'imaging dal vivo di tracciare divisioni cellulari singoli nel topo E8.5 neuroepitelio
Abstract
Abbiamo sviluppato un sistema che integra l'imaging dal vivo di marcatori fluorescenti e fette di coltura embrionale neuroepithelium mouse. Abbiamo approfittato di linee del mouse esistenti per la cellula genetica lineage tracing: una linea di Cre tamoxifene-inducibile e una linea giornalista Cre esprimendo DsRed su ricombinazione Cre-mediata. Utilizzando un livello relativamente basso di tamoxifene, siamo stati in grado di indurre ricombinazione in un piccolo numero di cellule, permettendo di seguire divisioni cellulari individuali. Inoltre, abbiamo osservato la risposta trascrizionale di Sonic hedgehog (Shh) di segnalazione utilizzando un Olig2-eGFP transgenico linea 1-3 e abbiamo monitorato formazione di ciglia infettando la fetta colta con virus che esprime il marcatore di ciglia, SSTR3-GFP 4. Per l'immagine del neuroepitelio, abbiamo raccolto gli embrioni a E8.5, isolato il tubo neurale, montata la fetta neurale in appropriate condizioni di coltura nella camera di imaging e di eseguita time-lapse imaging confocale. Il nostro exmetodo di imaging in vivo in diretta consente di tracciare divisioni cellulari singoli di valutare la relativa tempistica di formazione ciglia primarie e risposta Shh in modo fisiologicamente rilevanti. Questo metodo può essere facilmente adattato utilizzando marcatori fluorescenti distinti e fornisce il campo gli strumenti con cui monitorare il comportamento delle cellule in situ ed in tempo reale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro sistema ex vivo permette di osservare direttamente divisioni cellulari singoli all'interno del neuroepitelio in tempo reale via di sviluppo. Come esempio abbiamo esaminato divisioni cellulari entro il mouse embrionale tubo neurale e vigilato o formazione ciglio o risposta Shh. Abbiamo confermato i nostri risultati di imaging (n = 24) erano coerenti con i risultati di sezioni fisse (n = 178) che indicano la nostra tecnica fornisce dati fisiologicamente rilevanti.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto di ricerca è stata sostenuta da un supplemento ARRA, 5 R01 NS056380. Ulteriore supporto è stato fornito tramite il vettore virale Core e Core Microscopia della Emory Neuroscienze NINDS Nucleo Facilities Grant, P30NS055077. Ringraziamo il mouse Emory transgenico e Gene Targeting Nucleo per derivare la linea di mouse da GENSAT; Greg Pazour per il SSTR3-GFP linea cellulare IMCD3 stabile e Bradley Yoder per il SSTR3-GFP lentivirali costruiamo. Gli anticorpi monoclonali sono stati ottenuti da studi di sviluppo Hybridoma Banca, sviluppato sotto l'egida del NICHD, e mantenuto dalla University of Iowa, Dipartimento di Scienze Biologiche, Iowa City, IA 52242. Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal IACUC e del Comitato Biosicurezza alla Emory University.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% petroleum jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Hoechst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
Referências
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