पूर्व vivo माउस neuroepithelium में सिंगल सेल प्रभागों के लाइव इमेजिंग
Summary
यहाँ हम के लिए आवश्यक उपकरणों का विकास<em> पूर्व vivo</em> रहते इमेजिंग माउस E8.5 neuroepithelium में एकल कोशिका विभाजन का पता लगाने के लिए
Abstract
हम फ्लोरोसेंट मार्करों और भ्रूण माउस neuroepithelium के संवर्धन के स्लाइस के रहते इमेजिंग एकीकृत एक प्रणाली विकसित की है. हम अनुरेखण वंश आनुवंशिक सेल के लिए मौजूदा माउस लाइनों का फायदा उठाया: एक tamoxifen-inducible Cre लाइन और Cre की मध्यस्थता पुनर्संयोजन पर dsRed व्यक्त एक Cre संवाददाता लाइन. Tamoxifen के एक अपेक्षाकृत कम स्तर का उपयोग करके, हम हमारे व्यक्तिगत कोशिका विभाजन का पालन करने की अनुमति, कोशिकाओं की एक छोटी संख्या में पुनर्संयोजन को उत्पन्न करने में सक्षम थे. इसके अतिरिक्त, हम एक Olig2-EGFP ट्रांसजेनिक लाइन 1-3 का उपयोग कर ध्वनि का हाथी (श) संकेत करने ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया मनाया और हम सिलिया मार्कर, Sstr3-GFP के 4 व्यक्त वायरस के साथ सुसंस्कृत टुकड़ा संक्रमण से सिलिया के गठन पर नजर रखी. छवि के क्रम में neuroepithelium, हम न्यूरल ट्यूब अलग, E8.5 पर भ्रूण काटा, इमेजिंग कक्ष में समुचित संवर्धन परिस्थितियों में तंत्रिका टुकड़ा घुड़सवार और समय चूक confocal इमेजिंग प्रदर्शन किया. हमारे पूर्वविवो रहते इमेजिंग विधि हमें एक physiologically प्रासंगिक ढंग से प्राथमिक cilia गठन और श्श्श प्रतिक्रिया के सापेक्ष समय का आकलन करने के लिए एकल कोशिका विभाजन का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है. इस विधि को आसानी से अलग फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग कर अनुकूलित और क्षेत्र में सीटू और वास्तविक समय में सेल के व्यवहार पर नजर रखने के साथ जो उपकरण प्रदान किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे पूर्व vivo प्रणाली हमें सीधे वास्तविक समय में विकासशील neuroepithelium भीतर एकल कोशिका विभाजन का निरीक्षण करने के लिए सक्षम बनाता है. एक उदाहरण के रूप में हम माउस भ्रूण न्यूरल ट्यूब के भीतर कोशिका विभाजन …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध परियोजना के एक ARRA के अनुपूरक, 5 R01 NS056380 द्वारा समर्थित किया गया था. अतिरिक्त समर्थन वायरल वेक्टर कोर और एमोरी न्यूरोसाइंस NINDS कोर सुविधाएं अनुदान, P30NS055077 के माइक्रोस्कोपी कोर के माध्यम से प्रदान किया गया. स्थिर SSTR3-GFP IMCD3 सेल लाइन के लिए ग्रेग Pazour, हम GENSAT से माउस लाइन पाने के लिए एमोरी ट्रांसजेनिक माउस और जीन लक्ष्य निर्धारण कोर धन्यवाद और Sstr3-GFP lentiviral लिए ब्राडली Yoder निर्माण. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी NICHD के तत्वावधान में विकसित विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक से प्राप्त की और आयोवा विश्वविद्यालय, जीव विज्ञान विभाग, आयोवा सिटी, आइए 52,242 से बनाए रखा गया. सभी जानवर प्रक्रियाओं IACUC और एमोरी विश्वविद्यालय में जैव सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% petroleum jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Hoechst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
Referências
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