Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס
Summary
כאן אנו מפתחים את הכלים הדרושים ל<em> לשעבר vivo</em> הדמיה לחיות להתחקות חלוקות תא בודדות בneuroepithelium עכבר E8.5
Abstract
פיתחנו מערכת המשלבת הדמיה חיה של סמני ניאון ופרוסות של culturing neuroepithelium עכבר העוברי. אנחנו ניצל את קווי עכבר קיים לתא גנטי שושלת התחקות: קו Cre טמוקסיפן מושרה וקו כתב Cre מביע DsRed על רקומבינציה Cre בתיווך. על ידי שימוש ברמה נמוכה יחסית של טמוקסיפן, היינו יכול לגרום לרקומבינציה במספר קטן של תאים, המאפשר לנו לעקוב חלוקות תא בודדות. בנוסף, צפו את תגובת תעתיק לקיפוד איתות קולי (ששש) באמצעות Olig2-eGFP מהונדס קו 1-3 ואנחנו במעקב היווצרות של ריסים על ידי הדבקת הפרוסה התרבותית בווירוס המבטאת את סמן הריסים, Sstr3-GFP 4. כדי תמונת neuroepithelium מסקנו עוברים בE8.5, בודד את הצינור העצבי,, רכוב על הפרוסה העצבית בתנאי culturing נכונים לתוך חדר ההדמיה וביצע הדמיה confocal זמן לשגות. האקס שלנושיטת ההדמיה vivo החי מאפשרת לנו לעקוב אחר חלוקות תא בודדות כדי להעריך את התזמון היחסי של היווצרות ראשונית ריסים ותגובה ששש באופן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. ניתן להתאים שיטה זו בקלות באמצעות סמני ניאון ברורים ומספקת בתחום הכלים שבם כדי לפקח על התנהגות תא באתר ובזמן אמת.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת vivo לשעבר שלנו מאפשרת לנו להתבונן חלוקות תא בודדות ישירות בתוך neuroepithelium הפיתוח בזמן אמת. כדוגמה נבחנו חלוקות תא בתוך הצינור העצבי העוברי בעכבר והפיקוח או היווצרות cilium או תגובה ששש. אנחנו אישר את תוצאות ההדמיה שלנו (n = 24) עלינו בקנה אחד עם תוצאות מסעיפים ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט מחקר זה נתמך על ידי מוסף ערה, 5 R01 NS056380. תמיכה נוספת מסופקת באמצעות וקטור ויראלי הליבה והליבה מיקרוסקופית של אמורי Neuroscience NINDS Core מתקני המענק, P30NS055077. אנו מודים לעכבר המהונדס אמורי וCore מיקוד גן הנובע מקו עכבר GENSAT; גרג Pazour לשורת התאים היציב SSTR3-GFP IMCD3; ובראדלי Yoder לlentiviral Sstr3-GFP לבנות. נוגדנים חד שבטיים, התקבלו ממחקרי Hybridoma הבנק התפתחותית, שפותח בחסות NICHD, ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, מחלקה למדעי ביולוגיה, איווה סיטי, IA 52242. נהלי כל החיה שאושר על ידי ועדת IACUC והבטיחות הביולוגית באוניברסיטת אמורי.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% petroleum jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Hoechst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
Referências
- Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
- Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
- Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
- Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
- Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
- Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), (2012).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).
