Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel
Summary
Hier entwickeln wir die notwendigen Werkzeuge für<em> Ex vivo</em> Live-Aufnahmen zu verfolgen einzelne Zellteilungen in der Maus E8.5 Neuroepithel
Abstract
Wir entwickelten ein System, das Echtzeit-Bildgebung von fluoreszierenden Markern und Kultivierung von embryonalen Maus Scheiben Neuroepithel integriert. Wir nutzten vorhandene Mauslinien für genetische Zelllinie Tracing: eine Tamoxifen-induzierbare Cre Linie und einer Linie, die Cre-Reporter auf Cre-vermittelte Rekombination dsRed. Durch die Verwendung einer relativ niedrigen Tamoxifen, waren wir in der Lage, um eine Rekombination in einer kleinen Anzahl von Zellen zu induzieren, was uns erlaubt, einzelne Zellteilungen folgen. Darüber hinaus beobachtet man die transkriptionelle Reaktion auf Sonic Hedgehog (Shh) Signal mit einer Olig2-eGFP transgenen Linie 1-3 und man überwacht Bildung von Zilien mittels Infektion des kultivierten Scheibe mit Virus, das die Wimpern Marker SSTR3 4-GFP. Um das Bild Neuroepithel wir geerntet Embryonen bei E8.5, isoliert das Neuralrohr, montiert die neurale Scheibe in der richtigen Kulturbedingungen in die Kammer und Bildgebung durchgeführt Zeitraffer-konfokale Bildgebung. Unsere exLive vivo-Bildgebungsverfahren ermöglicht es uns, einzelne Zellteilungen zu verfolgen, um die relative Timing Hauptwimpern Bildung und Shh Antwort in einem physiologisch relevanten Weise zu beurteilen. Dieses Verfahren kann leicht angepasst werden, mit unterschiedlichen fluoreszierenden Markern und bietet das Feld die Werkzeuge, mit denen das Verhalten der Zelle in situ und in Echtzeit zu überwachen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unsere Ex-vivo-System ermöglicht es uns, direkt beobachten einzelne Zelle Spaltungen innerhalb der Entwicklung Neuroepithel in Echtzeit. Als Beispiel haben wir untersucht Zellteilungen im embryonalen Neuralrohrdefekten und überwacht entweder Cilium Bildung oder Shh Antwort. Wir bestätigten unsere Imaging-Ergebnisse (n = 24) waren konsistent mit den Ergebnissen aus festen Abschnitten (n = 178), die unsere Technik bietet physiologisch relevanten Daten.
Unsere Tech…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Forschungsprojekt wurde von einem ARRA Supplement, 5 R01 NS056380 unterstützt. Zusätzliche Unterstützung wurde durch den viralen Vektor-Core und der Mikroskopie Kern der Emory Neuroscience NINDS Core Facilities Grant, P30NS055077 vorgesehen. Wir danken der Emory Transgene Maus und Gene Targeting-Core für die Ableitung der Maus Linie von GENSAT; Greg Pazour für die stabile SSTR3-GFP IMCD3 Zelllinie; und Bradley Yoder für den SSTR3-GFP lentiviralen Konstrukt. Monoklonale Antikörper wurden aus dem Developmental Studies Hybridoma Bank unter der Schirmherrschaft des NICHD entwickelt, erhalten und gepflegt von der University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. Alle tierischen Verfahren wurden vom IACUC und der Kommission für Biosicherheit an der Emory University genehmigt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% petroleum jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Hoechst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
Referências
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