Ex vivo Live-Imaging van Single Cell Divisies in Muis neuroepithelium
Summary
Hier ontwikkelen we de instrumenten die nodig zijn voor de<em> Ex vivo</em> Live-imaging tot enkele celdelingen in de muis E8.5 neuroepithelium traceren
Abstract
We ontwikkelden een systeem dat levende beeldvorming van fluorescente markers en het kweken plakjes embryonale muis neuroepithelium integreert. We hebben gebruik gemaakt van de bestaande muis lijnen voor genetische cell lineage tracing: een tamoxifen-induceerbare Cre lijn en een Cre reporter lijn expressie DsRed bij Cre-gemedieerde recombinatie. Door het gebruik van een relatief laag niveau van tamoxifen, waren we in staat om recombinatie te induceren in een klein aantal cellen, waardoor ons toe om individuele divisies cel volgen. Daarnaast zagen we de transcriptionele respons op Sonic Hedgehog (Shh) signalering met behulp van een Olig2-eGFP transgene lijn 1-3 en we gecontroleerd vorming van cilia door de gekweekte slice met virus dat de trilharen marker, Sstr3-GFP 4 infecteren. Om het imago van de neuro-epitheel, we geoogst embryo's in E8.5, geïsoleerd van de neurale buis, bevestigd de neurale schijfje in de juiste kweekomstandigheden in de beeldvorming kamer en deed time-lapse confocale beeldvorming. Onze exvivo live-imaging methode stelt ons in staat om enkele celdelingen traceren om de relatieve timing van primaire cilia vorming en Shh reactie in een fysiologisch relevante wijze kan worden gemeten. Deze methode kan eenvoudig worden aangepast met behulp van verschillende fluorescente markers en geeft het veld de instrumenten waarmee naar cel gedrag in situ en in real time te volgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onze ex vivo systeem stelt ons in staat om direct waar te nemen enkele cel verdeeldheid binnen de ontwikkeling neuroepithelium in real time. Als voorbeeld nemen we onderzocht celdelingen in de muis embryonale neurale buis en bewaakt ofwel cilium vorming of Shh respons. We bevestigden onze beeldvorming resultaten (n = 24) waren in overeenstemming met de resultaten uit vaste rubrieken (n = 178) met vermelding van onze techniek biedt fysiologisch relevante gegevens.
D…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door een ARRA Supplement, 5 R01 NS056380. Extra steun werd verleend via de virale vector Core en de Microscopie Kern van de Emory Neuroscience NINDS Core Facilities subsidie, P30NS055077. Wij danken de Emory Transgene muis en gene targeting Core voor het afleiden van de muis lijn van GENSAT; Greg Pazour voor de stabiele SSTR3-GFP IMCD3 cellijn, en Bradley Yoder voor de Sstr3-GFP lentivirale construct. Monoklonale antilichamen werden verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank, ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD, en onderhouden door de Universiteit van Iowa, Afdeling Biologische Wetenschappen, Iowa City, IA 52242. Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de IACUC en het Biosafety Comite aan de Emory University.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% petroleum jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Hoechst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
Referências
- Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
- Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
- Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
- Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
- Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
- Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), (2012).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).
